全自动DNA切胶仪精准筛选GUIDE-seq2测序文库，验证CRISPR-Cas9酶变体PAM序列特异性

2026-04-07 16:38:00, 环亚生物环亚生物科技有限公司

背景知识：

传统CRISPR-Cas9被誉为“基因剪刀”，Cas9酶识别的前提是目标DNA旁边存在一个“protospacer adjacent motif”（PAM）序列，但也限制了靶点的选择范围。工程化和表征蛋白质可能既耗时又繁琐，“通用型”CRISPR-Cas 酶虽然可以应用多样化的基因组编辑，但这类酶往往脱靶率高、切割效率低。

理想的基因编辑工具，应针对特定靶点 “精准打击”—— 既可以扩大靶向覆盖，又能够降低脱靶风险，甚至可以实现等位基因特异性编辑。因此，需筛选海量的酶变体并验证其 PAM 特异性，而传统实验方法效率低下，难以应对百万级别的酶库筛选需求。

2025年4月22日美国麻省总医院和哈佛医学院的科学家们在《Nature》杂志发表了题为“Custom CRISPR-Cas9 PAM variants via scalable engineering and machine learning”的研究文章，堪称CRISPR技术发展的里程碑。

研究团队通过基于结构/功能的饱和诱变和细菌筛选，获得了近 1000 种工程化的SpCas9酶，并对它们的PAM需求进行了表征，以此训练一个将氨基酸序列与 PAM 特异性联系起来的神经网络。并利用由此产生的 PAM 机器学习算法（PAMmla）预测 6400 万种 SpCas9 酶的 PAM。PAMmla 将机器学习和蛋白质工程深度融合，构建了一个拥有不同 PAM 需求的 SpCas9 酶资源库，为开发更安全、高效的 CRISPR 基因组编辑技术奠定了基础。

在该研究中，GUIDE-seq2 作为全基因组脱靶效应评估的核心技术，主要应用于验证 PAMmla 预测的定制化 SpCas9 酶的特异性。GUIDE-seq2可作为细胞水平、无偏好、全基因组范围捕获 CRISPR 切割位点的金标准技术。

本文中GUIDE-seq2实验流程：

1、细胞转染与样本制备：将核酸酶表达质粒、sgRNA 质粒、dsODN 标签与转染试剂共转染 HEK 293T 细胞，72 小时后提取基因组 DNA 并定量。

2、靶向整合验证：通过 PCR 扩增、文库构建和NGS测序，结合 CRISPResso2 分析，计算 dsODN 标签在靶向位点的整合比例，评估靶向编辑效率。

3、GUIDE-seq2 核心反应：制备含条形码和 UMI 的 Tn5 转座体，对基因组 DNA 进行标签化反应，经蛋白酶 K 终止反应、磁珠纯化后，用特异性引物进行 PCR 扩增。

4、文库质控与测序：由Sage Science公司的 Pippin Prep 全自动DNA片段回收仪精准进行DNA特定片段筛选（DNA size selection）： 250-500bp 片段以纯化NGS文库，去除更长或更短的非目标DNA片段，制备高质量二代测序文库，提高NGS测序质量。定量后混合为 2nM 最终文库，使用 Illumina NextSeq1000/2000 测序。

5、数据分析：用更新版 GUIDE-seq2 软件（max_mismatches=6）分析测序数据，鉴定全基因组范围内的脱靶位点，对比定制化酶与传统酶（SpG、SpRY）的脱靶风险。

通过PAMmla模型，研究人员预测了全部6400万个可能变体的PAM特异性，并从中挑选出针对不同PAM的最优变体进行实验验证。GUIDE-seq2 检测显示，定制化酶的靶向范围更窄，其脱靶位点数量较传统 “通用型” 酶减少 26%-96%。，脱靶率显著降低。

美国Sage Science公司的全自动DNA片段回收仪为实验提供精准片段筛选功能，为 GUIDE-seq2 等关键实验提供了高纯度、高质量的测序文库。

通过PAMmla预测的变体在人类细胞中展现出优异的性能，不仅编辑效率高，脱靶风险还大幅降低。文中研究团队已将PAMmla模型和ISDE方法开源，提供在线工具（pammla.streamlit.app）与全库预测数据，研究者输入目标 PAM 即可秒级获得定制酶序列。综上所述，PAMmla的开发标志着基因编辑工具从"通用型"向"定制型"的转变，为各种基因编辑应用提供了更加安全、高效的选择。为精准基因治疗、安全碱基编辑和单等位基因疾病干预奠定技术平台。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09021-y

厂家介绍

Sage Science 公司位于美国马萨诸塞州，2010年成立，专注于核酸领域的样品制备，2万篇文献中应用，包括众多Nature、 Science、 Cell系列的文章，是DNA片段筛选回收领域的行业金标准。

Blue Pippin全自动DNA脉冲场电泳回收仪：

采用双通道电泳回收专利技术，全自动运行；
高精度回收、微量样品回收、高得率回收；
全自动完成DNA片段分选, 软件中自由选择需要筛选的片段范围；
免去了切胶纯化的繁琐步骤，比核酸片段筛选磁珠更加精准可控；
用于小片段DNA筛选回收，如小RNA/small RNA文库回收、cfDNA／ctDNA回收（循环血游离DNA／循环血肿瘤DNA）；
用于大片段DNA（几kb、几十kb甚至几百kb）精准回收，如Pacbio HiFi文库构建、纳米孔测序建库、超长测序（Ultra Long Sequencing）文库构建等；