间充质干细胞的半自动扩增和下游处理过程
2022-07-21 20:02:36, ESCO 益世科生物(Esco Lifesciences Group)
近年来,自体细胞疗法在再生医学与潜在治疗领域受到广泛关注,特别是间充质干细胞 (MSC) 衍生疗法,已经被认为是最成熟的细胞疗法。工业生物反应器每次最少需要生产108-109个细胞作为单次使用批量,用来满足生产稳定性和运行效率的要求。Esco Aster 利用Tide Motion(潮汐式) 平台来扩增锚定依赖性细胞,以获得符合治疗所需的高质量、性能优良的产品。CelCradle 生物反应器集成了灌流系统、 pH 值实时控制以及溶解氧 (DO)监测等自动化模块,本研究将重点关注在满足GMP自体细胞治疗应用以及符合GMP要求的前提下,CelCradle 生物反应器及半自动细胞收获系统(SAH)对上下游工艺整合流程的适用性和生产效率。
间充质干细胞的半自动扩增和下游处理过程
UC-MSCs 首先在 T 方瓶中复苏,然后接种至CelCradle扩大培养。再使用细胞收获系统 (SAH) 自动收集细胞,最后进行两步下游处理,纯化和浓缩。
CelCradle中生长与扩增
荧光染色图显示了在 Celcradle中,经过13天的培养后,UC-MSCs在BioMesh载体上的一个典型的扩增。其中绿色代表: 二乙酸荧光素(活细胞质) ; 红色代表: 碘化丙啶(死细胞核),比例尺: 200um。
将UC-MSCs 接种于CelCradle中,接种量为45,000个细胞每片载体,通过13天的培养,每片载体上达到2,100,000个细胞,扩增倍数为46.89(群体倍增数:5.32)。
代谢物监测
采用生物分析仪对培养期间的新陈代谢情况进行日常监测。包括培养基中的葡萄糖、谷氨酰胺和其他代谢产物的监测,以保证其量值在细胞生长的可接受范围内,同时作为更换培养基的评估依据。
半自动细胞收获系统收集细胞
通过荧光染色图可以看出半自动细胞收获系统具有较高的细胞收获效率,其中绿色代表: 二乙酸荧光素(活细胞质),比例尺: 200um。
从 CelCradle中随机选取3片载体并收集载体上的细胞,计算细胞总数,以此来估算整个培养瓶中的细胞总数。假设以从小规模采样估算的总细胞计数为100% ,那么细胞收获系统(SAH)的细胞收获效率为94.29%。
整个下游处理过程时间为2个小时。先用聚酰胺网过滤三次进行初纯,然后用切向流过滤(TFF)纯化间充质干细胞。
进行5倍浓缩大约需要30分钟,然后再进行30分钟的5倍透析。透析阶段的平均过滤通量为50 LMH 左右,缩短了TFF 过程时间。
下游工序各个阶段细胞活力和细胞回收率。TFF 处理后,细胞回收率在80%以上,且细胞活力高于90%。
每个处理步骤后将细胞重新接种在12孔板中,均表现出正常的再附着能力以及正常的形态,比例尺: 200um。
总结
①总体而言,经过17天的培养,UC-MSCs总数由4,300,000个增加到1,203,616,071个,相当于279,91倍的扩增或8.13的群体倍增数,并维持94.09%的细胞活力。
②整个下游纯化和 TFF过程仅需2小时,细胞回收率在80%以上,且细胞活力超过 90%。
③这项研究表明了潮汐式生物反应器在间充质干细胞培养中的适用性。特别是将 CelCradle与半自动细胞收获系统和下游 TFF过程的整合,为满足 GMP要求的自体细胞治疗应用和同种异体种子细胞制备提供了可行的上下游处理工艺。
1# Semi-automated expansion and downstream processing of mesenchymal stromal cells for autologous cell therapy(来源:Esco Aster Pte Ltd, Singapore, Singapore)
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