No.220｜大阪曹達的PC HILIC，非一般的HILIC！

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亲水作用液相色谱是用于分析强极性和可解离化合物的强有力的分析技术。

在HILIC出现之前，对于强极性化合物的分析，在采用正相液相色谱法时，不仅非水溶性的流动相使用会带来环保负担，并且很多待测物的溶解性也很不理想。

HILIC使用正相色谱亲水的极性固定相并由大量有机溶剂和少量含水缓冲物混合构成流动相体系，在HILIC中使用的各种亲水极性固定相都可从含高比例有机溶剂与少量水缓冲物组成的流动相中吸附水分子，在其表面形成一个“富水层”，待测物可在这一“富水层”和流动相中的“有机溶剂层”中进行亲水液液分配（如下图）而被保留和分离。

通常情况下HILIC型色谱柱填料表面的残留去质子化硅羟基（—SiO-）和其键合的官能团对硅胶表面的覆盖率不高。裸露的硅胶表面使得除“富水层”所带来的液液分配作用之外，在HILIC分析中还应当考虑不希望的其他种类的分子间相互作用，如静电相互作用、氢键作用（如上图）、偶极诱导作用或疏水作用等。

HILIC分离模式中，HILIC色谱柱如何形成和保持稳定的“富水层”，对实验过程的稳定和实验结果的重现尤为重要。常见的HILIC型固定相的介绍简单整理如下表。

PC HILIC采用磷酸胆碱（PC）为固定相，磷酸胆碱是构成细胞膜的成分，其具有的甜菜碱结构不仅拥有优秀的亲水性，还具有良好的生体样品惰性，能有效抑制蛋白质的吸附。

PC HILIC固定相中除磷酸胆碱基团（带电荷但呈中性）外，其独有的中性“Linker”结构同样亲水性卓越，为形成稳定的“富水层”提供双加成的同时，降低了静电相互作用，使复杂流动相的使用更加安心。

大阪曹達除提供常规的全多孔硅胶色谱柱PC HILIC外，也提供核壳型硅胶的色谱柱CAPCELL CORE PC，无论是常规HPLC分析，还是UHPLC分析都能轻松应对。

在HILIC模式下，固定相表面形成了“富水层”，样品在流动相和“富水层”之间进行分配。因此，与反相色谱的常识相反，与水相亲和力较强的极性化合物反而容易得到保留，而疏水性化合物基本不被保留。从下面的实验可以看出，在HILIC模式下，随着流动相中有机相比例的增加，极性化合物的保留呈现出增强的趋势。

【色谱条件】

色谱柱：PC HILC S5; 

             4.6mmi.d. x 250mm

流动相：10 mmol/L甲酸铵，X%乙腈

流   速：1.0 mL/min

温   度：40 ℃

检   测：UV 254 nm

样   品：1.萘，2.胸腺嘧啶，

             3.腺嘌呤，4.胞嘧啶

与通常使用的硅胶柱相比，PC HILIC在酰胺基和磷酸胆碱的双重作用下，“富水层”更加稳定且“厚重”，在实际分析中表现出更强的亲水性，对极性化合物的保留效果更好。

【色谱条件】

色谱柱：S5; 4.6mmi.d. x 250mm

流动相：10 mmol/L甲酸铵，乙腈/ 水

             = 90 / 10

流   速：1.0 mL/min

温   度：40 ℃

检   测：UV 254 nm

样   品：1.萘，2.胸腺嘧啶，3.胞嘧啶

HILIC模式下有机相比例高于水相比例，在高有机相下MS检测器的灵敏度更高。以强极性化合物环丙氨嗪（灭蝇胺）和三聚氰胺的分析为例（参考GB 29704-2013），在2倍于常规流速的条件下也能达成良好的保留和分离。

【色谱条件】

色谱柱：CAPCELL CORE PC S2.7;

             2.1 mm i.d. × 50 mm

流动相：A，0.01mol/L乙酸铵+0.1%甲酸；

             B，乙腈+0.1%甲酸

             B% 95%(0 min)->95%(1.0 min)

              ->70%(2.0 min)->70%(3.0 min)

              ->95%(3.1 min)

流   速：0.4 mL/min

温   度：40 ℃

检   测：Qtrap 5500,ESI,Positive,MRM

进样量：2 µL

浓   度：250 ng/mL

CAPCELL CORE PC S2.7是在核壳型硅胶表面键合PC基团而成，因HILIC模式下流动相中有机相比例较高，即使使用150mm长度的核壳型色谱柱，在2倍的流速下，也可以在20Mpa的常规HPLC上使用。

【色谱条件】

色谱柱：CAPCELL CORE C18 S2.7; 

             2.1 mm i.d. × 150 mm

流动相：10 mmol/L甲酸铵 / 乙腈 = 15 / 85

流   速：0.4 mL/min

温   度：40 ℃

检   测：UV 254 nm

进样量：1 µL

样   品：1.胸腺嘧啶，2.尿嘧啶，

             3.腺嘌呤，4.胞嘧啶，

             5.鸟嘌呤 各5ppm

CAPCELL CORE PC S2.7和PC HILIC相比，比表面积降低，保留能力有所减弱，但其核壳型色谱柱高理论塔板数的特点非常明显。

【色谱条件】

流动相：10 mmol/L甲酸铵 / 乙腈 = 10 / 90

流   速：0.4 mL/min

温   度：40 ℃

检   测：UV 254 nm

进样量：1 µL

样   品：1.胸腺嘧啶，2.尿嘧啶，

             3.腺嘌呤，4.胞嘧啶，

             5.鸟嘌呤 各5ppm