No.200｜HILIC模式下样品溶剂中“水”是如何影响峰型的？

大阪曹達｜三耀精细

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今天，YoYo老师带来一期久违的技术科普文章！

液相色谱分析有很多模式，反相、正相、离子交换、HILIC，还有混合模式等等。这次我们就来聊聊亲水相互作用HILIC模式，平时使用HILIC色谱柱的老师应该也不在少数，但是我们可能也没有仔细分析过，溶剂中水的含量对于HILIC模式分离情况的影响。

下面我们以栀子苷和京尼平苷酸在HILIC（亲水性相互作用）模式下的峰型和分离为例来进行说明。

栀子苷是中药山栀子中所含的一种糖苷类物质，具有促进胆汁分泌、引起腹泻的功效。京尼平苷酸则是杜仲里所含糖苷的代表成分，可以延缓或预防由于饮食或生活习惯引起的高胆固醇、高血压、高血脂等常见健康问题。

由于这两种物质都是高极性的糖苷类物质，在疏水性的ODS色谱柱上保留很弱，无法被完全分离，所以需要用到HILIC模式进行分析。使用OSAKA SODA PC HILIC色谱柱在高有机相条件下，能够有效分离这类亲水性化合物。

图1   标准物色谱图

HPLC Conditions ：

色谱柱 : PC HILIC S5 ; 2.0  mm i.d. × 250 mm

流动相 : 0.1 vol% CH3COOH, H2O / CH3CN = 10 / 90

流   速 : 200 μL/min

温   度 : 40 ℃

检测器 : UV 254 nm

进样量 : 2 μL

溶   剂 : H2O / CH3CN = 10 / 90

众所周知，HILIC模式的形成，需要在极性固定相表面形成一个富水层，这通常需要使用高比例的有机溶剂作为流动相，一般有机相比例要≥70%，同时有机相比例越高，保留时间将有延长趋势。

但对于极性化合物来说，通常水溶性比较好，那么以水作为溶剂溶解的样品，在HILIC模式下是否会产生溶剂效应的影响呢？我们做了相应比较实验。

在流动相配比相同的情况下,样品溶剂中水的比例不同，可以明显看到对峰形的影响（图2）。

图2 　样品溶剂的影响

如上图所示，各峰的峰形随着样品溶剂中水的比例增加而逐渐变宽。由于使用10/90浓度的溶剂和使用流动相（10/90，添加乙酸）作为溶剂的峰形几乎没有区别，因此水的比例不同时对峰型的影响更大。

将两种化合物的理论塔板数和不对称因子对样品中水的比例作图（图3）。虽然有细微的差别，但两者显示了相似的趋势。从这些数据里可以看出，在HILIC模式分析中，溶剂中的水比例和流动相相同或者低于流动相比例时，可以得到更好的峰型和最佳分离效果。因此在使用HILIC模式进行样品分析时，推荐使用流动相作为样品溶剂，以得到最好分析结果。

图3   两者的理论塔板数和不对称因子

PC HILIC 色谱柱

大阪曹達独立研发的两性离子型亲水色谱柱——PC HILIC，键合为PC（磷酸胆碱）基团，它是构成细胞膜的成分，拥有高亲水性和生体适应性。