microGRID联合MALDI-2的亚细胞成像技术

2022-07-17 03:57:06, 质谱成像先锋队布鲁克（北京）科技有限公司-质谱仪器

摘要

商业MALDI成像质谱仪一般无法在低于10μm的横向空间分辨率得到数据采集的一致性和持久稳定性。这里介绍了布鲁克最新开发的microGRID技术，对于timsTOF fleX空间组学质谱仪而言，它可以提高MALDI成像的空间分辨精度，从而实现高难度的单细胞分析。与MALDI-2后电离技术相结合，布鲁克提供了兼具高空间分辨率和高灵敏度的单细胞分析性能，从而使亚细胞成像成为常规实验室的工具。

近年来，在分子水平上了解生物变化的复杂过程越来越受到人们的关注。因此，进一步提高成像技术在高空间分辨率和高灵敏度的稳定性是实现分子分布全面可视化，并将其与生物功能和起源联系起来的关键。然而，要达到几个微米的空间分辨率是一个很大的挑战，需要使用者具备很好的仪器设置和优化能力。此外，随着空间分辨率的不断提高，对质谱仪灵敏度的要求也随之增加。在这里，我们要介绍microGRID技术，它将MALDI样品台和Smartbeam 3D激光束定位相结合，以5μm的靶板移动步长均匀打点，得到高空间分辨率成像的高质量数据。结合布鲁克独特的MALDI-2后电离技术，timsTOF fleX质谱平台可在高空间分辨率下获得所需的灵敏度和持续稳定性。

各种生物样品的实验数据显示了microGRID的优异成像性能。该技术利用样品台位置精确测量和反馈校正激光束照射位置，将高分辨率成像精度提高到5μm像素间距。此外，使用MALDI-2后电离可以检测常规MALDI中通常没有响应的分析物，并使小像素点的少量分子得到检测。

将上述技术与包括IntelliSlides^®在内的成像设置方法相结合，以及初学者和专家都可以使用的SCiLS™ autopilot流程和实现强大的单细胞分辨率。该工作流程是布鲁克SCiLS Lab™成像数据分析软件的一部分。

实验方法

为了说明这种方法的能力和未来应用范围，我们测试了不同样本包括组织和细胞培养物。首先，使用直径5μm激光聚焦对组织成像，研究了不同磷脂在小鼠脑、睾丸和肾脏切片中的横向分布。其次，我们展示了使用MALDI-2时离子产量的改善，最后，我们展示了对不同细胞系的脂质和代谢物的亚细胞分布成像结果。

将组织（小鼠大脑、大鼠睾丸和大鼠肾脏）切成10μm厚的薄片，并贴在IntelliSlides^®上解冻制备切片样本。载玻片存放在真空盒中待用。使用HTX SprayerM3+基质喷雾仪制备样本，通过预设方法和DHB基质对大脑和睾丸和NEDC基质对肾脏施加基质。

THP-1和Caki-2细胞培养和制备根据Bien等人^[1,2]方法进行，由德国明斯特大学Dreisewerd实验室提供。细胞从德国微生物和细胞培养物集合中获得，并直接在8孔室玻片中培养，直到达到亚融合。对于THP-1单核细胞，用200ng/mL佛波醇12肉豆蔻酸13醋酸盐刺激72小时，然后在纯培养基中再培养72小时，即可分化为巨噬细胞。培养后，根据[1]中的方案，用PBS清洗细胞，并用福尔马林化学固定。对于荧光显微镜，使用Hoechst 33342和麦胚凝集素对细胞核和细胞膜进行染色10分钟，然后使用PBS和150mM醋酸铵进行额外洗涤步骤。然后移除腔室，样品干燥过夜，并使用定制的升华腔室升华DHAP基质。

在timsTOF fleX MALDI-2系统上采集样本数据，该系统配备了microGRID技术，能够实现高精度的5μm空间分辨率，并使用MALDI-2后电离提高灵敏度。

实验结果

从生物系统获得的信息深度和数量主要取决于质谱仪的分析灵敏度和可操作的分子分布横向分辨率。

实现最大横向分辨率不仅需要合适的最小激光焦点直径，而且同样重要的是，需要精确的样品定位，即精确的MALDI平台位置测量。在μm级范围内，即头发直径的1/50，精确的机械定位是非常困难的。然而，测量实际位置是完全可能的。microGRID利用这些特性，使用线性编码器在100nm范围内确定MALDI平台的准确位置，以主动将激光聚焦位置补偿到样品上的正确光斑。整个过程是完全自动的，无需用户进一步干预。这将在两个组织样本上显示出空间分辨率低至5μm的高精度图像（图1）。

图1：microGRID timsTOF fleX 在 5 μm 空间分辨率的 MALDI 图像。A.大鼠肾脏样本使用负模式 B. 大鼠睾丸样本正模式. 左图为光学图像，并标出了测量区域（红色轮廓）和3个代谢产物和脂质的相应离子图像。

这里，在负离子模式下，在大鼠肾脏上以5μm的空间分辨率测量的离子分布表明，在髓质和骨盆区域（见图1A）可以分辨非常精细的结构，而不会出现条纹或信号衰减等过采样伪影。在图1B中，使用microGRID在5μm处对大鼠睾丸样本的一小部分进行成像。

凭借高度稳定的空间分辨率，睾丸内的细微结构清晰可见，例如，可以将间质中的睾丸间质细胞与生精小管区分开来。

已经证明，MALDI-2能够使各种类型分析物的可检测性提高几个数量级^[3]。随着样品上激光光斑直径的减小，烧蚀样本的量也随之减少，MALDI-2的使用对于充分利用小像素获取信息变得至关重要。图2显示了连续大鼠脑切片在5μm像素、正模式MALDI和MALDI-2测量值的比较。此外，小脑的精细结构，白质、灰质和颗粒层，也被划分并清晰可见。选定脂质区的离子图像很好地显示了传统MALDI使用5μm像素时可能出现的3种不同情况。图2A显示了m/z 734.5703的离子分布，表明MALDI和MALDI-2几乎没有差异，而图2B中的示例显示了使用MALDI-2的灵敏度增加了约2倍。在第三个示例图1C中，传统的MALDI灵敏度不再足够检测到信号，但使用MALDI-2后获得灵敏度提高，m/z 501.2583的离子分布变得可见。

图2：MALDI（左）和MALDI-2（右）模式下 microGRID 成像的比较。显示了大鼠脑组织某小脑区域的离子图像。从连续切片中以正离子模式以 5 μm 空间分辨率记录数据。m/z 734.5703 的离子分布在 MALDI 和MALDI-2 中显示出几乎相同的强度。m/z 788.6168 的 B 离子图像，其中 MALDI-2 和 m/z 501.2583 的 C 离子图像，其中在 5 μm 像素大小的 MALDI 模式下灵敏度不够。只有提高 MALDI-2 的灵敏度，才能在这种情况下检测到精细结构。

由于真核细胞是生命的最小单位，高分辨率成像不可避免地要在微米范围内解析这些结构，并识别单个细胞之间和内部的生物分子分布。图3和图4显示了microGRID成像与MALDI-2在这一新兴领域的巨大作用

在5μm的空间分辨率下，通过不同m/z值的图像，可以清楚地区分和识别细胞大小为30-50μm的单个THP-1细胞（图3）。这里，PC 34:1是一种常见的甘油磷脂，在m/z 782.5683 [m+Na]⁺被检测到，它在完整的细胞培养物和单个细胞的质膜中都呈均匀分布（图 3A）。然而，在m/z 974.7506 [m+H]⁺检测到一种鞘糖脂，很可能是Hex2Cer 18:1; O2/24:0，显示更离散的分布（图3B），定位于单个细胞的中心，可以识别细胞内结构，并将这种脂质与细胞器联系起来（图3C）。虽然5μm像素致烧蚀和电离样品量大幅减少，但仪器灵敏度和MALDI-2的信号增强可以得到单细胞m/z谱图，包含足够强度的脂质和代谢物的信号，而不是“噪音”谱（图3D）。

图3：THP-1 细胞培养、分化后巨噬细胞 MALDI-2 离子图像，使用 microGRID，5 μm 空间分辨率。在细胞（A、B）两种不同结构的定位和叠加（C）。单个细胞的 m/z 谱图在整个质量范围内显示低噪音良好的信号（D）。

当成像分辨率在低微米范围时，样品制备策略变得越来越重要，因为脂质移位和基质不均匀性等伪影在微米范围内出现。通过Bien等人^[1]所述的样品制备优化策略，microGRID现在能够使成像分辨率达到最高极限，并允许细胞精细结构的可视化。例如，Caki-2细胞发育时的大小在20-80μm范围变化，5μm的分辨率可以获得精细结构（图4）。在这里，不仅细胞核在适当的 m/z 值下变得可见（图4A），而且可以观察到精细结构，这些信号仅以单个像素表示（图4B和4C的比较）。同样，由约 40个像素组成的单细胞质谱（图4D）信息更丰富，显示了脂质范围内的丰富信号。

图4：Caki-2 细胞培养的 MALDI-2 离子图像, 正模式，使用 microGRID，5 μm 空间分辨率. A. PE 36:2，m/z 744.5547 的离子分布显示Caki-2细胞的定位，红色轮廓区域放大图。B. 放大区域 m/z 图像的比较，B 和相应的荧光图像（细胞核的 Hoechst 33342 染色和细胞膜的 WGA染色）C.显示了非常精细结构的良好相关性。D. 单个细胞的 m/z谱图，在 B 中突出显示。

结论

timsTOF fleX系统配备microGRID技术，可实现低至5μm的横向高分辨率质谱成像。通过使用线性编码器在100nm范围内确定MALDI平台的准确位置，MALDI激光束将自动校正到最佳位置。这项全自动技术可以帮助专业和非专业用户需要的高空间分辨率生物分子成像。结合使用提高灵敏度的MALDI-2，microGRID现在可以对各种类型组织甚至单个亚细胞精细结构的分子分布进行可视化分析。

如果您对这一技术感兴趣，可以进入布鲁克直播间，观看报告回放 | microGRID联合MALDI-2的亚细胞成像技术。