HILIC-TIMS快速正交分离和异构体解析质谱法深度分析磷脂组成

2023-08-11 19:48:22, 夏天布鲁克（北京）科技有限公司-质谱仪器

近期，清华大学化学系瑕瑜教授课题组与清华大学药学院尹航教授课题组以及北京大学第一医院巩艳青泌尿外科副研究员合作在Nature Communications杂志上发表了题为 “Deep-profiling of phospholipidome via rapid orthogonal separations and isomer-resolved mass spectrometry” 的文章。论文第一作者为清华大学化学系2018级博士生夏天，通讯作者为瑕瑜教授。在该研究中，作者将亲水作用色谱（HILIC）、捕集离子淌度（TIMS）及异构体解析串联质谱（MS/MS）有机集成，发展了具有数据自动解析能力的磷脂组深度分析系统，实现多种生物样品磷脂组的快速、灵敏、高覆盖定性定量分析。

生物样品的脂质组通常包含数千种脂质分子，并伴有多种脂质同分异构体和同重分析物，且各类脂质浓度跨越6-8个数量级。目前脂质常用分析方法是通过液相色谱（LC）结合质谱（MS）进行分析，然而脂质研究领域仍缺乏快速有效的脂质异构体通用分离方案。此外，即使脂质异构体成功得到分离，但由于缺乏标准品，也难以指认出它们的具体结构。

针对上述脂质分析挑战，作者开发一种新型的脂质组学分析流程，该分析流程融合了HILIC和TIMS的正交分离能力与异构体解析MS/MS技术，并具有快速（液相色谱运行时间<10分钟）、灵敏度高（在nM级别检测生物样品中的磷脂）和覆盖范围广等独特的分析优势，可以提供磷脂的C=C位置信息和PC的sn位置信息。同时，使用自制软件LipidNovelist进行数据分析，实现脂质异构体的质谱数据自动解析。

如图1所示，为了准确解析磷脂的结构，作者构建了一个3步数据采集的分析流程。分析流程的第一步是在负离子模式下进行非靶向质谱数据采集，通过6.5分钟的HILIC-TIMS-MS运行，实现在脂质总组成水平上的相对定量，并尽可能多的检测磷脂的链组成信息，同时分析PC的sn位置。采用非靶向的数据采集方式使得在每个LC运行中采集超过5000张MS² CID谱图，覆盖八个主要磷脂类别。

分析流程的第二步则是在C=C位置水平上对磷脂进行分析，对脂质提取物进行离线2''，4''，6''-三氟苯乙酮（triFAP） PB衍生化反应，接着对PB衍生的脂质进行了靶向MS/MS分析，PB-MS/MS数据可导入到自制的数据处理软件LipidNovelist中，实现在C=C位置水平上对磷脂结构进行鉴定。分析流程的第三步创建了一个样品专属的总脂肪酸（TFA）数据库，其中包含样品中各类TFA的C=C位置信息。在对磷脂的triFAP PB-MS/MS质谱数据进行分析时，会将样品专属的TFA数据库用作先验知识，提高对磷脂双键位置的准确鉴定。

图1 磷脂精细结构解析的分析流程。

作者使用牛肝极性脂质提取物对所建立的分析流程进行基准测试，鉴定出400多种磷脂的C=C位置，并绘制了许多磷脂的C=C位置异构体和PC的sn-异构体的相对含量。与之前的HILIC-在线丙酮PB-MS/MS分析流程相比（Nat. Commun. 2019, 10 (1), 79），由于灵敏度提高，脂质鉴定数目翻倍。

图2 通过HILIC-MS² CID、HILIC-TIMS-MS² CID和HILIC-TIMS-PB-MS² CID技术鉴定牛肝中磷脂的链组成和C=C位置信息。

接着，在对RAW 264.7巨噬细胞磷脂组的分析过程中，作者发现了大量不寻常的脂肪酰基不饱和位点。通过将总脂肪酸谱的变化与去饱和酶活性的变化（包括SCD1和FADS2）相关联，证实了这些不寻常双键位置异构体的存在。作者从RAW 264.7细胞中鉴定出超过一千种不同的磷脂结构；这些结构多样性也突出了脂质组异构体分析的必要性。

在脂质精细结构水平进行定量还对疾病诊断具有意义。与正常对照相比，人膀胱癌组织中多种异构体显示出显著的组成变化（图3），如果不区分异构体，这种变化将被掩盖。总的来说，该分析流程为磷脂的精细结构解析提供了一个全面且易于采用的解决方案，可应用于基础研究和临床研究。

感谢国家自然科学基金委（No. 22225404）、国家科技部重点研发计划（2018YFA0800903）提供的经费支持。

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图3 在C=C位置和sn位置水平分析人膀胱癌组织和正常组织中的磷脂（N=6）。

编辑：夏天

审核：瑕瑜；简瑞君

瑕瑜教授团队

瑕瑜教授团队发展了一系列基于自由基化学的生物质谱方法，推动了质谱对生物大分子化学结构的深度解析能力。代表性工作包括建立了对脂质组精细结构鉴定和异构体定量方法，在本领域重要期刊发表论文100余篇，参与撰写章节专著三部。2013年获美国质谱学会的研究奖，2015-2017年担任美国质谱协会理事会秘书, 2017年获得国家优秀青年科学基金资助, 2022 年年获得国家杰出青年科学基金资助。现担任 “Journal of Mass Spectrometry” 编辑和国际脂质组学学会（ILS）副主席，国际质谱学会理事会亚太地区联系人。