凯撒的归凯撒，上帝的归上帝——三个带电化合物的峰型解决带来的启发

带电化合物，特别是带强电荷的化合物在开发HPLC方法时，有可能会遇到峰型问题，比较典型的带正电荷的碱性化合物会呈现当样品过载时才出现的直角三角形峰，有些文献也将这种现象称为“热力学过载（thermodynamic overload）”。除了这种峰型，也可以出现其他不良峰型，原因也比较复杂。

星谱实验室在一直专注于为星谱科技的用户解决关于保留、峰型和分离度的难题，我们虽然对这种问题暂时没有特别深入的理论研究，但是在多个难题的解决过程中，也总结出了一个简单的方式，那就是如标题所引用的耶稣的名言——“凯撒的归凯撒，上帝的归上帝（Give back to Ceasar what is Ceasar''s and to God what is God''s）”，也就是用电荷的方式解决由于电荷造成的峰型问题。下面将通过三个案例分享我们的解决问题的思路：

案例一：有机酸的分析（见应用两种模式下多种有机酸的HPLC分析）

我们的Horizon Aqua C18是一款耐水的C18，常被用于增强疏水性不够强的化合物的保留，因此我们选择它来分析有机酸，使用的是酸性（pH 2.0）的纯水相（如图1）：

图1 Horizon Aqua C18分离多种有机酸的色谱图

我们发现pKa最低的三氟乙酸（pKa = 0.23）峰型最差，而且也是明显的过载（直角三角形）峰型，可能和该pH条件下，三氟乙酸电离程度还是比较高，所带的电荷比较多有关。于是我们选择Artchrom H这款色谱柱，利用离子交换作用来保留三氟乙酸，发现可以使三氟乙酸获得较好的峰型：

图2 Artchrom H分离3种有机酸的色谱图

案例二：一个碱性化合物的峰型优化（带离子交换的HILIC方法）

这个化合物最初的方法是使用氨基柱，使用HILIC模式，但是存在明显的拖尾，如下图所示：

图2 使用氨基柱分析该碱性化合物

经过调整流动相比例后仍无法明显改善峰型。考虑到该化合物的活性N的pKa在8左右，因此尝试碱性流动相，抑制化合物中N的活性，使用的色谱柱为耐宽pH的Artchrom WP C18，发现出现峰后基线下降，且保留仍比较弱：

图3 使用碱性条件分析该碱性化合物

我们也尝试使用反相体系，酸性流动相中添加离液剂（KPF₆），仍然无法改善峰型，且保留还是比较弱。我们分析了以上的结果，尝试了一种新HILIC模式，使用的色谱柱为Horizon Silica，这种HILIC柱与氨基柱不一样的是，它能提供比较充分的阳离子交换作用，结果发现果然可以使化合物获得足够的保留和优秀的峰形：

图4 使用Horizon Silica在HILIC模式下分析该碱性化合物

案例三：一个两性化合物的分析（离子对方法）

我们首先尝试使用Horizon Aqua C18，酸性流动相下，发现该化合物出现双峰（如图5），可能和该化合物的酸性基团的pKa比较低（约1.8），在该流动相条件下存在多种电离状态有关。

图5 酸性体系分析该两性化合物

我们考虑过提高pH来改变该化合物的电离状态，让状态更均一，但是这将降低该化合物的疏水性，更加不利于其保留。因此我们尝试在酸性条件下加入离子对试剂——庚烷磺酸钠，在保留机理中增加阳离子交换作用，成功获得该两性化合物单一且对称的峰型。

图5 酸性体系分析该两性化合物

我们也利用此策略，协助了用户解决了酒石酸，柠檬酸和苹果酸的分析难题。

全文总结

我们基于文献和三个带强电荷化合物的峰型优化工作，总结出一个解决带强电荷的化合物的峰型问题的一个思路，那就是通过引入电荷的作用来获得更好的峰型，包括但不限于使用有带有明显离子交换作用的色谱柱、加入离子对试剂等等，希望可以给广大用户朋友的工作带来启发。我们希望在这个方面上做更多的理论和实践的工作，也将在后续的推文、直播或者其他形式的内容分享中与大家交流。

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