更温和？更简单？更可靠？一种抗原特异性 T 细胞克隆的新方法

首先采集健康供体的血液细胞，用密度梯度离心法分离健康人血中的外周血单核细胞 PBMC 细胞。

在体外，作者利用 1μg/mL CEF 肽库（CTL Eu­rope GmbH）处理来自健康供体样品的总 PBMC，结合 MHC-I 分子，活化特异性 CD8+ T 细胞，并用 IL7（5ng/mL）和 IL2（20UI/mL）细胞因子培养细胞 14 天。

用 live/dead 染料标记死活，anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8 对细胞膜蛋白进行染色后，Cytofix/CytopermTM 对细胞进行固定和破膜，用 anti-IFNγ 和 anti-TNFα 染色，通过流式细胞术分析评估 T 细胞对 CEF 肽库的特异性，测定约 25% 的 CD8+ T 细胞在 CEF 刺激下产生了 IFNγ。

对分泌 IFNγ 的 CEF 特异性 CD8+ T 细胞通过 IFNγ 磁性介导的 T 细胞分选进行富集，并在含有辐照饲养层细胞、150UI/mL IL2 和 1pg/mL PHA 的条件下培养 14 天。细胞内 IFNγ 染色后，通过流式细胞术分析 CD8+ T 细胞特征进一步增强了（ Fig. 2）。

Fig.2 流式分析工作流程中 CD8+ T 细胞的特征

使用 DispenCell 对富集的 CEF 特异性 CD8+ T 细胞进行单细胞克隆。研究人员共分离了三块 96 孔板用于测试 DispenCell 分配细胞克隆效率和可重复性，并使用 DispenSoft 对单细胞分离进行基于阻抗的质量控制。同时采用有限稀释方法作为对照，分离后在含有辐照饲养层细胞，150UI/mL IL2 和 1pg/mL PHA 的条件下 T 细胞培养扩增 14 天。

根据基于颗粒大小的直方图（Fig.3A），将筛选阈值设置为 100 欧姆，以区分单个 T 细胞与碎片。软件将含有不同数目颗粒的孔用颜色加以区分以便质量控制（Fig.3B）。在该图中，只有包含单个细胞的孔以绿色标记，而其他孔则以红色标记，阻抗显示单细胞（Fig.3C）和双细胞（Fig.3D）的峰值特征。使用相同的软件，我们可以访问每个孔的阻抗曲线，以进行额外的质量控制。

Fig.3 DispenCell 分离单细胞的质量控制

单细胞分离平均效率（绿色孔的百分比）为 83%，每块板的平均分配时间为 8 分钟。结果证明了 DispenCell 基于阻抗的单细胞分配技术的高效性和实用性，另外根据阻抗分布，软件可提供即时的单克隆性理论证明。

作者为了进一步证明 DispenCell 分离后细胞的单克隆性，对 DispenCell 或有限稀释克隆方法分离的 CD8+ T 细胞克隆进行了 TCRβ 链测序。通过检测同一样品中 TCRβ 位点的单克隆重排来证明样品的单克隆性。测序分析表明，两种克隆方法的样品中 TCRβ 链主要为单克隆重排（Fig.4A），在使用 DispenCell 生成的 27 个生长克隆中，其中 25 个呈现对应于 T 细胞单克隆的单一优势 TCR β 链序列（Fig.4B）。而通过有限稀释，仅 18 个 T 细胞克隆表现单一优势 TCRβ 链序列。DispenCell 提供了比有限稀释更高的单克隆效率和可靠性。

作者研究了 DispenCell 克隆方法对 CD8+ T 细胞功能的影响。使用 CEF 肽库进行体外刺激后，细胞内流式细胞术分析表明，通过 DispenCell 分离并扩增的 CD8+ T 克隆能够产生大量的 IFNγ 和 TNFα（Fig.4C）。这些结果表明，DispenCell 克隆方法不会改变特定 CD8+ T 细胞克隆的功能。

Fig.4 CD8+ T 细胞单克隆性和功能特征的验证