酵母单杂交技术与互作组学

2022-06-30 19:42:27, 星标关注上海欧易生物医学科技有限公司

编者按

随着分子生物学研究进入以蛋白质组学为标志的后基因组时代，蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用已成为互作组学研究的热门主题。

人类基因粗略约编码2万种蛋白，只算一对一的相互作用种类也有12万到100万种。而加上动态变化，每个物种、个体、细胞中都存在着一张张不同的互作网络图，这一张张图谱中，蕴藏着各种生命的奥秘。

有两种通用的相互作用组图谱绘制方式：

第一种酵母杂交试验，通过偶联基因表达体现细胞内发生直接相互作用的蛋白对。

第二种是通过抗体/标签分离纯化复合体，然后用质谱鉴定复合体内部组分，识别直接相互作用或间接相互作用的蛋白质。两种高通量方法彼此互补，相互验证。

今天小编给大家分享一篇酵母单杂交技术绘制互作图谱的文章。快来了解互作组研究的打开方式吧。

关于HIV想必大家都不陌生，感染HIV病毒后潜伏周期长，且目前没有完全的治愈方法。为了彻底治愈HIV，不让其发病就要从2方面入手：要么消除潜伏感染的细胞，要么防止潜伏原病毒的细胞被激活。也就是需要抑制HIV病毒的转录。

但是关于HIV在人细胞中的复制、转录和潜伏期调控的分子网络仍不完全确定，所以目前HIV仍不能被根治。为了帮助解决这个问题，波士顿大学的研究者，使用酵母单杂交筛选技术，以HIV-1,HIV-2的LTR（启动子和增强子）为诱饵，筛选了人的转录因子文库（包含1086个人的转录因子），最终绘制了调节HIV-1和HIV-2的转录网络图谱，结果发表在2021年的PNAS杂志上。

研究结论

（1）鉴定了42个转录因子与3个HIV-1 LTRs（NL4-3、REJO和CH058）和2个HIV-2 LTRs（ROD9和GH1）的结合，共计85对相互作用（Fig1-A）。这些转录因子在CD4+T细胞被刺激前后存在差异表达（Fig1-B）。值得注意的是，本研究中作者以1500 bp的HIV-1NL4-3gag-pol为诱饵进行了阴性对照筛选实验，结果未获得与之互作的转录因子，说明了HIV-1 LTRs和HIV-2 LTRs转录元件筛选的特异性。

Fig.1 Enhanced Y1H screen reveals human transcription factor interactions with HIV LTRs. (A) Results of eY1H assays.(B) Transcription factor expression in CD4+ T cells.

（2）构建了HIV的转录调控与生化进程网络图谱。使用PANTHER对筛选到的转录因子及其互作子进行通路富集分析，共鉴定到了29条通路（Fig2-A)，其中大部分与CD4+T细胞功能相关，包括toll-like受体信号通路、Wnt、TGF-β、T细胞激活和p53（Fig2-B)。

Fig. 2. Identification of transcriptional and biochemical networks.

（3）在筛选到的转录因子中，KLF2和KLF3对HIV-1的转录存在抑制作用。KLF2和KLF3在激活的感病细胞中表达量显著下降（Fig3-B)。对KLF2或KLF3敲降后，导致未受刺激的静息CD4+T细胞中HIV-1RNA总表达显著增加，但是双突（敲降），表达量未加倍，说明KLF2和KLF3可能在同一通路上发挥抑制HIV-1转录的功能，或者功能存在冗余（Fig3-C)。通过检测发现KLFs过表达后，与LTR连接的萤火素酶表达显著下降，进一步证明了KLF2和KLF3对HIV-1的转录存在抑制作用。

Fig. 3. KLF2 and KLF3 regulate HIV-1 transcription in CD4+ T cells.

（4）在筛选到的转录因子中，PLAGL1促进HIV-2转录。PLAGL1在免疫细胞中广泛表达，并与HIV的其他转录激活因子，即Sp1、AP-1和PCAF/CBP/P300存在相互作用，本研究中显示HEK293T 细胞中，PLAGL1过表达后，与LTR连接的萤火素酶表达上升近2倍，说明PLAGL1是一个转录激活因子。

值得一提的是，文章的背景介绍内容中，对应用其他技术（如RNAi、 scRNA-seq、CRISPR等）对HIV转录调控方向的已有成果分析，发现这些方法为HIV-1的复制和潜伏期提供了见解，但并没有直接评估转录因子的结合和功能。文章中也对酵母单杂交技术与其他互作组技术（如Chip-seq、motif 预测）进行了比较分析，发现eY1H技术对已识别因子的验证率为30-60%，同等或优于其他技术。

以上就是小编今天想为大家分享的内容了，能不能带给你一些科研思路或启发呢？？

还记得2021年王二涛老师的cell封面文章吗？同样应用Y1H筛选技术，绘制了丛枝菌根共生的“自我调节”互作组图谱。具体以51个水稻启动子为诱饵筛选了水稻转录因子文库（含1570个水稻TFs)，发现了一个由266个转录因子和47个靶启动子组成的高度互联的网络，构建了丛枝菌根共生的基因调控互作网络图。