No.83｜不用衍生，不加离子对，液-质法直接分析多种氨基酸，全靠它！

这是大曹色谱的第83条推送

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背  景

蛋白质由氨基酸组成，是构成细胞、组织、乃至生命的基础物质。氨基酸的平衡和适量的供应是人体健康的基本前提，任何一种氨基酸供应缺乏，都会影响人体正常生理功能。对体内氨基酸代谢变化的研究，有助于某些特定疾病的判别，也可用于对病理过程及代谢通路进行相关研究。

但是，氨基酸现有分析方法尚存在很多问题，主要包括极性氨基酸无法保留和紫外吸收差等，因此主流分析方法常通过衍生化试剂衍生或添加离子对试剂的方法来进行分析。

氨基酸分析难点

★ 极性强：氨基酸分子结构中存在氨基和羧基结构，极性强，在反相模式下不易保留

★ 紫外吸收差：常规紫外检测器难以获得高灵敏度检测

通常做法

★ 衍生化 → 操作复杂，对衍生环境条件及氨基酸结构会有一定要求，对于来源于生物样品的复杂体系影响大，加大后期数据处理难度

★ 离子对试剂方法 → 影响质谱离子源的离子化

首先尝试在不同分离模式下进行分析：在常规反相模式下分析，可看到保留不足的问题；在HILIC模式下进行保留分离能得到良好结果，但是对样品前处理要求很高；而离子交换模式下，对于碱性氨基酸无法得到洗脱，或峰形不好。

最后，综合分析原理和前期结果，选取了双重保留机理模式的CAPCELL PAK CR进行分析——

★ 氨基酸解离后N上能够带正电荷，因此使用阳离子交换可以实现氨基酸保留；

★ 同时，不同氨基酸的R基不同，引入的反相机理可以加强氨基酸之间的分离作用。

混合模式色谱法可以将不同的液相机理作用结合，在一次样品分析中同时检测疏水性和极性（或可解离带电荷）化合物。

在使用CAPCELL PAK CR色谱柱的双重保留机理基础上进行了18种氨基酸的LC-MS方法建立，包括流动相筛选、建立三元梯度洗脱方法、前处理方案优化，以及方法学验证等工作。

▲双重保留模式下氨基酸标准品分析谱图

在CAPCELL PAK CR 1 : 4 色谱柱的双重保留机理模式下可完成18种氨基酸的液质检测，在简单的流动相条件下即可得到良好分析结果。

本方法流动相条件简单，灵敏度高，可用于血清和尿液中游离氨基酸分析，为生物样品中氨基酸检测或其它复杂基质中氨基酸的检测提供了新的方法和思路。

【参考文献】

DOI: 10.19756/j.issn.0253-3820.181599