GUT | 香港中文大学于君教授组多组学揭示膳食胆固醇促进脂肪肝相关肝癌的发生新机制

2022-04-19 00:34:04, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

前言

香港中文大学医学院于君教授课题组在Gut期刊发表的题为 “Dietary cholesterol drives fatty liver-associated liver cancer by modulating gut microbiota and metabolites ”的研究成果，通过粪便微生物16S rRNA测序和血清LC-MS代谢组研究方法，发现了胆固醇调节的微生物群在 NAFLD-HCC 中的直接作用，并发现阿托伐他汀恢复了胆固醇诱导的肠道菌群失调并完全阻止了 NAFLD-HCC 的发展。确认了膳食胆固醇通过诱导小鼠肠道微生物群和代谢物的改变来驱动 NAFLD-HCC 的形成。胆固醇抑制治疗和肠道菌群操作可能是预防 NAFLD-HCC 的有效策略，为治疗NAFLD-HCC提供了理论依据。

基本信息

中文标题：膳食胆固醇通过调节肠道微生物群和代谢物来驱动脂肪肝相关的肝癌

研究对象：小鼠

发表期刊：Gut

影响因子：23.059

发表时间：2020 年7月

研究单位：香港新界香港中文大学消化疾病研究所及内科及药物治疗学系

运用生物技术：血清代谢组分析、微生物16S rRNA测序

研究背景

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 是代谢综合征的肝脏表现，包括从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 的一系列肝脏病变。NASH 可进展为肝硬化、终末期肝功能衰竭和肝细胞癌 (HCC)。在肝脏脂质种类中，胆固醇被认为是 NASH 发展中的主要脂毒性分子。肝脏是调节全身胆固醇稳态的中心。在 NASH 的人类和实验模型中都证实了肝脏胆固醇稳态的异常。我们发现角鲨烯环氧酶是胆固醇生物合成中的一种限速酶，可促进 NAFLD-HCC 的发展。膳食胆固醇对血浆和肝脏胆固醇稳态具有重要影响。长期胆固醇治疗对自发性和进行性 NAFLD-HCC 发展的作用和发病机制尚不清楚。

肠道微生物群与其宿主具有共生关系，并通过在大肠中代谢包括胆固醇在内的膳食成分来提供营养和能量。研究表明，肠道微生物组是导致 NAFLD 发展及其进展为 NAFLD-HCC 的环境因素。然而，肠道菌群失调是否是膳食胆固醇诱导的 NASH 和 NAFLD-HCC 进展的原因或影响仍不清楚。

本研究确定膳食胆固醇在 NAFLD-HCC 发展中的作用和相关分子机制。我们发现膳食胆固醇通过胆固醇诱导的肠道微生物群变化和代谢组学改变导致自发的 NAFLD-HCC 形成。胆固醇抑制恢复了肠道微生物群并完全阻止了 NAFLD-HCC 的发展。

研究思路

研究结果

膳食胆固醇自发驱动 NAFLD-HCC 的发展

为了检查膳食胆固醇在脂肪变性、NASH、纤维化和NAFLD-HCC 演变中的作用，给小鼠喂食 HFHC、HFLC 或 NC。在不同时间点（3、8、10、12 和 14 个月）监测血清甲胎蛋白（AFP，肝癌标志物）水平。与喂食 HFHC 的小鼠相比，在第 10 个月观察到 AFP 水平升高（107.1±127.9 ng/mL），在第 12 个月（151.6±129.3 ng/mL）和第 14 个月（174.2±203.1 ng/mL）进一步升高在第 14 个月使用 HFLC（HFLC 中为 50.9±7.5 ng/mL）或 NC（59.7±20.9 ng/mL）（图 1A）。MRI 扫描显示 HFHC 喂养的小鼠在第 14 个月时出现肝肿瘤，但在 HFLC 喂养或 NC 喂养的小鼠中没有发现（图 1B ）。然后在第 14 个月收获小鼠。在 68% (13/19) 喂食 HFHC 的小鼠中发现肝肿瘤，但在喂食 HFLC 或 NC 饮食的小鼠中没有发现肝肿瘤（图 1C）。肝脏切片的组织学检查证实所有肝脏肿瘤均为 HCC（图 1C），每只小鼠平均有 2.7±2.6 个 HCC，最大肿瘤直径为 4.1±5.0 mm。与 HFHC 喂养的小鼠相比，HFHC 喂养小鼠的肝脏切片中 Ki-67 阳性细胞明显增多，表明 HFHC 喂养小鼠的细胞增殖增加（图 1C）。这些结果表明，膳食胆固醇可以自发诱导 NAFLD-HCC 的形成。

随着 HCC 的形成，与 NC 喂养的小鼠相比，HFHC 喂养的小鼠在第 14 个月时体重、内脏脂肪、肝脏重量和肝体重比显着增加（图 1D）。喂食 HFLC 的小鼠体重、内脏脂肪和肝脏重量也有所增加（图 1D）。与 HFLC 喂养或 NC 喂养的小鼠相比，HFHC 喂养的小鼠的血清胆固醇、肝脏游离胆固醇和胆固醇酯、葡萄糖耐受不良和空腹胰岛素显着增加（图 1E）。与 NC 相比，在喂食 HFLC 的小鼠中也观察到增强的葡萄糖耐受不良和空腹胰岛素（图 1E）。

图1 | 胆固醇在 C57BL/6 小鼠中诱导自发 HCC 形成

a)喂食 HFHC 饮食 3、8、10、12 和 14 个月的小鼠以及喂食 NC 或 HFLC 饮食 14 个月的小鼠的血清 AFP 水平；

b)肝脏 MRI,

c)喂食 NC、HFLC 和 HFHC 14 个月的小鼠肝脏中 Ki67 染色的代表性大体形态、代表性显微特征和免疫组织化学图片, Ki-67 根据以下标准评分: 0 ( <10 %细胞染色）、1（11 % –30% 细胞染色）、2（30 % –50% 细胞染色）或 3（>50 %细胞染色）

d)喂食 NC、HFLC 的小鼠的体重、内脏脂肪、肝脏重量、肝脏重量比、

e)血清胆固醇水平、肝脏游离胆固醇、肝脏胆固醇酯含量、葡萄糖耐量试验和空腹胰岛素水平和 HFHC 14 个月。

喂食高胆固醇饮食 14 个月的小鼠出现 NASH 和纤维化

肝脏切片的进一步检查显示，在 HFHC 喂养 14 个月的小鼠的 HCC 邻近肝组织和非 HCC 肝组织中存在以脂肪变性和小叶炎症为特征的脂肪性肝炎，而在 HFLC 喂养的小鼠中仅观察到脂肪变性（图 2A）。与组织学炎症一致，与喂食 HFLC 或 NC 的小鼠相比，喂食 HFHC 的小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT) (p<0.01) 和天冬氨酸氨基转移酶 (AST) (p<0.01) 水平显着增加（图 2B）。血清和肝脏促炎细胞因子包括 IL-6、IL-1α 和 IL-1β（图 2C、D）在 HFHC 喂养的小鼠中增加。RNA测序表明，与HFLC喂养的小鼠相比，14个月HFHC喂养小鼠的肝组织中关键的NASH相关促炎细胞因子，包括Cx3cl1、Mcp1、Cxcl10、Mip1β、Mip1α、Ccl5、Cxcl16和Tnfα，显着上调（图 2D）。

HFHC 喂养的小鼠表现出严重的纤维化损伤，胶原分布区域显着增加（图 2E），通过肝羟脯氨酸测定法测定的胶原含量（图 2F）和肝星状细胞活化，如增加的 α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) mRNA 和蛋白质水平（图 2E）。对肝脏氧化应激的检查显示，在 HFHC 喂养的小鼠中，氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 与 NADH（NAD 的还原形式）的比率和抗氧化超氧化物歧化酶 (SOD) 活性显着降低（图 2G），表明肝脏氧化饮食胆固醇的压力。总的来说，这些发现表明 NASH 和纤维化是在 HFHC 喂养小鼠的非 HCC 肝组织中形成的。

图2 | 胆固醇在喂食 HFHC 饮食的小鼠的非 HCC 肝组织中引起 NASH 和纤维化。

a)具有代表性的 H&E 染色、肝切片的组织学评分；

b)血清 ALT 和 AST 水平；

c)用 NC、HFLC 和 HFHC 喂养 14 个月的小鼠通过细胞因子分析测定的血清 IL-6、IL-1α 和 IL-1β 蛋白水平；

d)用 HFLC 和 HFHC 喂养的小鼠的 RNA 测序通过 ELISA 和 Cx3cl1、Mcp1、Cxcl10、Mip1β、Mip1α、Ccl5、Cxcl16、Tnfα mRNA 水平测定肝脏促炎细胞因子 IL-6、IL-1α 和 IL-1β 蛋白水平14个月；

e)天狼星红染色的胶原沉积，免疫组织化学染色和 RT-PCR 的 α-SMA 蛋白和 mRNA 水平

f)肝脏羟脯氨酸含量

g)用 NC、HFLC 和 HFHC 喂养 14 个月的小鼠的肝脏 NAD+ 与 NADH 比率和 SOD 活性。

高胆固醇饮食在小鼠中依次导致脂肪肝、脂肪性肝炎和纤维化

为了阐明饮食胆固醇在 HCC 形成之前 NAFLD 的进展，我们监测了喂食 HFHC 的小鼠的血清 ALT、AST、胆固醇、AFP 和肝脏组织学变化。在饮食喂养后 3、8、10 和 12 个月收获小鼠（图 3A）。我们观察到在 3 个月和 8 个月时，与喂食 HFLC 的小鼠相比，喂食 HFHC 的小鼠的体重和内脏脂肪重量增加，同时肝脏重量和肝体重比增加。血清 ALT 和 AST 的增加与 HFHC 喂养的小鼠血清胆固醇水平升高一致。HFHC 喂养小鼠的肝脏组织学显示，3 个月时有轻度炎症的脂肪变性，8 个月时伴有纤维化的脂肪性肝炎，10、12 和 14 个月时有 HCC 形成，而 HFLC 喂养的小鼠在 3、8 个月时仅显示脂肪变性而没有进一步的 HCC 发展。10 个月和 14 个月（图 3B）。我们还对两种 HCC 标志物 AFP 和高尔基蛋白 73 (GP73) 进行了免疫组化。

在 HFHC 喂养小鼠的肝组织上观察到阳性染色，但在 HFLC 喂养的小鼠身上没有观察到阳性染色。肝脏脂肪变性、小叶炎症和肝胶原区域的评分证实了整个疾病阶段肝脏组织学的严重程度增加（图 3B）。此外，10% (1/10) 的 HFHC 喂养小鼠在 10 个月时发展为 HCC（肿瘤数 = 0.1 ± 0.32，最大肿瘤直径 = 0.55 ± 1.74 mm），25% (3/12) 在 12 个月时发展为 HCC（肿瘤数=0.25 ± 0.45，最大肿瘤直径=1.57 ± 3.10 mm) 和 68% (13/19) 在 14 个月时发展为 HCC（图 3C），表明 HFHC 喂养的小鼠逐渐发展为脂肪变性、脂肪性肝炎、纤维化和 NAFLD–肝癌。

图3 | 喂食 HFHC 的小鼠依次发展为脂肪肝、脂肪性肝炎、纤维化和 HCC

a)用 HFHC 饮食治疗 C57BL/6 小鼠的示意图。在 3、8、10 和 12 个月大时处死小鼠。

b)喂食 HFLC 14 个月和喂食 HFHC 3、8、10、12 和 14 个月的小鼠肝脏中肿瘤标志物 AFP 和 GP73 的代表性大体形态、H&E 染色和 IHC 染色；计算脂肪变性和炎症的组织学评分以及天狼星红染色的定量。

c)不同时间点喂食 HFHC 的小鼠的最大肿瘤的肿瘤发病率、肿瘤数量和最大肿瘤直径。

在 NAFLD-HCC 的发生和发展过程中，膳食胆固醇诱导的肠道菌群失调

为了探索肠道微生物群在介导膳食胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 中的潜在作用，我们对 14 个月时喂食 HFLC 和喂食 HFHC 的小鼠的粪便进行了 16S rRNA 基因测序。分析表明，观察到的操作分类单元 (OTU) 数量达到饱和。通过主成分分析 (PCA) 在 14 个月时，在喂食 HFLC 和喂食 HFHC 的小鼠之间观察到肠道微生物群组成分离 (p<0.001) (图 4A )。此外，与 HFLC 饮食喂养的小鼠相比，在 14 个月时，在 HFHC 喂养的 HCC 小鼠中观察到较低的细菌多样性和增加的细菌丰富度（图 4A ）。通过差异丰度分析确定胆固醇相关的细菌类群。与喂食 HFLC 的小鼠相比，喂食 HFHC 的小鼠中几种细菌 OTU 的丰度存在差异（图 4B）。主成分和冗余分析还显示，喂食 HFHC 3 个月（伴有轻度炎症的简单脂肪变性）、8 个月（伴有纤维化的脂肪性肝炎）和 14 个月（HCC）的小鼠的微生物群组成明显聚集（图 4C），表明在NAFLD-HCC 进展阶段的肠道微生物群。此外，随着 NAFLD-HCC 的进展，细菌丰富度依次增加（图 4D）。特别是，观察到Mucispirillum schaedleri_Otu038、Desulfovibrio_Otu047、Anaerotruncus_Otu107和Desulfovibrionaceae_Otu073从 3 个月到 8 个月和 14 个月的 HFHC 喂养依次增加（图 4D）。此外，除其他外，我们观察到的富集梭菌个OTU如梭菌celatum_Otu070，C. ruminantium_Otu059，C. cocelatum_Otu036和C. methylpentosum_Otu053，以及耗尽Bifidobacterium_Otu026，Akkermansia municiphila_Otu034，Lactobacillus_Otu009，拟杆菌acidifaciens_Otu032，Bacteroides_Otu012，B. uniformis_Otu080和乙.egerthii_Otu079与高膳食胆固醇。此外，与 HFHC 喂养的无肿瘤小鼠相比，富含 HFHC 的甘曼尼螺杆菌_Otu031在有肿瘤的 HFHC 喂养的小鼠中更丰富，而在有肿瘤的 HFHC 喂养的小鼠中，与没有肿瘤的 HFHC 喂养的小鼠相比，HFHC 耗尽的拟杆菌属_Otu012 减少。这些表明，甘曼螺杆菌_Otu031的进一步富集和拟杆菌属_Otu012的消耗可能对肠道菌群在NAFLD-HCC中的作用很重要。此外，与 HFLC 喂养的小鼠相比，HFHC 喂养的小鼠肠道微生物群相关的色氨酸代谢能力降低（图 4）。这些综合起来表明，高胆固醇饮食会导致肠道菌群失调和微生物色氨酸代谢受损。

对细菌丰度与小鼠表型的潜在关联相关性分析。我们观察到M. schaedleri_Otu03 8, Desulfovibrio_Otu047, Anaerotruncus_Otu107, C. celatum_Otu070 , C. cocelatum_Otu036和C.methylpentosum_Otu053在 HFHC 喂养小鼠的粪便样本中富集呈正相关（图4F），而Bifidobacterium_Otu026, B. acidifac 、A. municiphila_Otu034和Lactobacillus_Otu009在 HFHC 喂养的小鼠中被耗尽，与高胆固醇饮食、血清和肝脏胆固醇水平呈负相关（图 4F）。这些结果表明 NAFLD-HCC 中的肠道菌群失调与胆固醇水平相关。

为了证实我们在人类患者动物实验中的发现，我们分析了 59 例高胆固醇血症患者和 39 名健康受试者的血清胆固醇和肠道微生物群的相关性。双歧杆菌和拟杆菌与血清总胆固醇和低密度脂蛋白 (LDL)-胆固醇呈负相关，但与高密度脂蛋白 (HDL)-胆固醇呈正相关（图 4G）。这些结果与喂食 HFHC 的小鼠的观察结果一致，进一步推断肠道微生物群参与了胆固醇诱导的疾病。

图4 | 膳食胆固醇诱导的肠道菌群失调。

a)14 个月 HFLC 和 HFHC 喂养的小鼠之间的主成分排序分析 (PcoA)、香农多样性和肠道微生物群的丰富度。

b)喂食 HFLC 或 HFHC 14 个月的小鼠粪便中细菌的热图。

c)分别喂食 3 个月、8 个月和 14 个月的 HFHC 后肠道菌群的 PCoA 和冗余分析。

d)通过 chao1 指数测量的微生物群丰富度，并在 HFHC 喂养的 3、8 至 14 个月内依次增加细菌。

e)HFLC 喂养和 HFHC 喂养小鼠的肠道微生物群色氨酸代谢能力。

f)细菌丰度与小鼠表型的相关性。

g)宏基因组测序与血清总胆固醇、甘油三酯、59 例高胆固醇血症人类病例和 39 名健康受试者中的 LDL-胆固醇和 HDL 胆固醇。

膳食胆固醇通过诱导代谢物改变促进 NASH-HCC 进展

为了揭示可能与胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 相关的与肠道微生物组相关的代谢表型，我们对喂食 HFHC 和喂食 HFLC 的小鼠的血清进行了代谢组学分析。根据 PCA 测定的膳食胆固醇含量，血清代谢物存在显着差异（图 5A）。胆汁酸生物合成是喂食高胆固醇饮食的小鼠中改变的关键途径（图 5B）。在 HFHC 喂养的小鼠中，包括牛磺胆酸 (TCA)、牛磺熊去氧胆酸 (TUDCA)、甘氨胆酸 (GCA) 和牛磺鹅去氧胆酸 (TCDCA) 在内的初级胆汁酸是异常上调的代谢物（图 5C）。另一方面，作为微生物色氨酸代谢产物的 3-吲哚丙酸 (IPA)在 HFHC 喂养的小鼠中是异常下调的代谢物（图 5C）。此外，与 HFLC 喂养的小鼠相比，HFHC 喂养的小鼠门静脉中血清脂多糖 (LPS) 浓度升高，结肠 E-钙粘蛋白丢失（图 5D），这表明膳食胆固醇会损害肠道屏障功能。进行相关性分析以确定 HFHC 改变的微生物和代谢物的潜在关联。一致地，相关性分析表明，富含 HFHC 的Mucispirillum schaedleri_Otu038与 TUDCA、TCDCA、TCA 和 GCA 呈正相关。富含 HFHCRoseburia_Otu056和Helicobacter_ganmanii_Otu031也与 TUDCA 和 TCDCA 呈正相关。此外，HFHC 耗尽的Akkermancia_muciniphila_Otu034与 TCDCA 和 TUDCA 呈负相关，而 HFHC 富集的Anaerotruncus_Otu107与 IPA 呈负相关（图 5E）。

进一步的实验表明，高膳食胆固醇不能改变胆汁酸合成酶的 mRNA 表达，包括肝脏中的细胞色素 P450 (Cyp)7a1、Cyp8b1、Cyp27a1 和 Cyp7b1（图 5F）。额外的体外实验表明，TCA 在人类正常永生化肝细胞系 LO2 中加重了胆固醇诱导的甘油三酯积累（图 5G），而 IPA 抑制了 NASH 中胆固醇诱导的脂质积累（图 5G）和细胞增殖（图 5H）– HCC细胞系，HKCI-2和HKCI-10。这些结果表明，胆固醇通过调节宿主血清代谢物以及至少部分通过增加 TCA 和减少 IPA 来促进 NASH-HCC 进展。

图5 | 膳食胆固醇诱导的小鼠血清代谢谱的改变。

a)通过主成分排序分析，喂食 HFLC 和 HFHC 饮食的小鼠的血清代谢物显着不同。

b)喂食 HFHC 饮食的小鼠中差异富集的代谢物的途径分析。

c)喂食 HFLC 和 HFHC 饮食的小鼠血清代谢组学火山图，显示了代谢物的异常值。

d)喂食 HFLC 和 HFHC 饮食 3 个月的小鼠门静脉血液中的 LPS 浓度和喂食 14 个月 HFLC 和 HFHC 饮食的小鼠结肠组织中 E-钙粘蛋白的表达。

e)HFHC 改变的微生物和代谢物关联的相关性分析。

f)喂食 HFLC 和 HFHC 饮食的小鼠肝组织中 Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1 和 Cyp7b1 的 mRNA 水平。

g)通过油红 O 染色，TCA 加重了胆固醇诱导的人 LO2 细胞系中的甘油三酯积累，而 IPA 抑制了 NASH-HCC 细胞系、HKCI-2 和 HKCI-10 中胆固醇诱导的甘油三酯积累。胆固醇，200 μg/mL；

h)IPA 抑制 NASH-HCC 细胞系中的细胞增殖。

高胆固醇调节的肠道微生物群促进无菌小鼠的脂肪性肝炎和肝细胞增殖

我们通过粪便微生物群移植（FMT）评估了胆固醇调节的微生物群在 NAFLD-HCC 中的贡献。在 NC 饮食下，将 NC 喂养、HFLC 喂养和 HFHC 喂养的小鼠（14 个月）的粪便灌胃给无菌小鼠（G-NC、G-HFLC 和 G-HFHC）（图 6A）。与 G-NC 小鼠相比，G-HFHC 小鼠的肝体重比显着更高。此外，甘油三酯测定和油红O染色（图6B）的肝脏脂质积累和硫代巴比妥酸反应物质测定（图6B）的过氧化显着增加，同时H＆E染色的肝脏组织学受损（图6B ）在 FMT 后 8、10 和 14 个月的 G-HFHC 小鼠中。通过细胞因子分析测定增强的肝细胞因子和趋化因子包括 IL-6（图 6C ），通过 cDNA 表达测定，Fos、Ccl12、Cxcr1、Ccl1、Myd88、Il-1β、Cxcl10 和 C3ar1。证明炎症增加与 G-HFLC 小鼠相比，通过流式细胞术在 G-HFHC 小鼠中增强 CD45+ 淋巴细胞积累。

在 14 个月时，在 G-HFHC 小鼠的肝脏中观察到肝细胞增殖增加（p<0.05）（图 6D），但在 FMT 后 8 个月和 10 个月则没有。癌症通路 PCR 阵列显示肝组织中涉及致癌通路的基因上调，包括细胞增殖 (Cdc20)、血管生成 (Pgf)、侵袭/转移 (Serpinb2、Snai3) 和参与细胞凋亡的基因 (Fasl 和 Lpl) 下调-HFHC 小鼠与 G-NC 和 G-HFLC 小鼠相比（图 6E1）。通过蛋白质印迹验证CDC20的上调（图6E2）。G-HFHC 小鼠在 14 个月时观察到一个肝结节，但在 8 和 10 个月时未观察到（图 6A）。组织学检查证实结节为具有小球和细胞增殖增加的不典型增生（图 6A）。我们评估了受体无菌小鼠及其相应的供体常规小鼠肠道微生物群的组成。我们发现，与供体饮食相关的受体无菌小鼠的肠道微生物群存在显着差异（图 6F）。如 β 多样性和组成分析所示，FMT 后的微生物生态系统在所有小鼠组中随时间保持稳定。此外，无菌小鼠血清代谢物分析显示，与喂食 HFHC 的常规小鼠相比，G-HFHC 小鼠的 IPA 降低（图 6G）。总之，这些数据表明膳食胆固醇调节的微生物群通过诱导代谢物改变来促进 NAFLD 和肝细胞增殖，从而促进胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 形成。

图6 | 高胆固醇调节的微生物群促进无菌小鼠模型中的肝细胞增殖

a)粪便从 NC 喂养、HFLC 喂养和 HFHC 喂养的小鼠（14 个月）移植到 NC 下的无菌小鼠（G-NC、G-HFLC 和 G-HFHC）。显示了 G-NC、G-HFLC 或 GHFHC 组灌胃无菌小鼠肝脏的大体形态、组织学检查和 Ki-67 染色。

b)G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 组的受体无菌小鼠在 8、10 和 14 个月时的肝脏甘油三酯含量、脂质过氧化和肝脏组织学。

c)G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 组在 14 个月时的肝脏 IL-6 蛋白水平和

d)Ki-67 染色。(E1) G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 小鼠肝组织中的小鼠癌症通路 Finder PCR 阵列。

e)CDC20 蛋白水平得到验证。

f)G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 小鼠肠道菌群线性判别分析 (LDA) 得分的主成分排序分析和直方图。

g)G-HFLC 和 G-HFHC 小鼠的血清代谢组学分析。

抗胆固醇治疗完全防止HFHC喂养小鼠的NAFLD-HCC形成

由于膳食胆固醇驱动 NAFLD-HCC 的进展，我们评估了抗胆固醇药物是否可以抑制 NAFLD 及其进展为 HCC。阿托伐他汀 (20 mg/kg) 是一种降胆固醇药物，对已喂食 HFHC 7 个月的小鼠给药，并继续喂食 HFHC 和阿托伐他汀 7 个月（图 7A）。在实验结束时（14 个月），阿托伐他汀完全阻止了 HFHC 饮食诱导的 NAFLD-HCC 形成，并改善了 NASH 的严重程度（图 7B）。这伴随着血清胆固醇、肝游离胆固醇、血清 AFP 显着降低（图 7C）、ALT、降低血清促炎细胞因子（IL-6、IL-1α、IL-1β、MCP-1、MIP-1α 和 MIP-1β）和氧化应激（增加 NAD+ 与 NADH 的比率和 SOD 活性）（图7D )。阿托伐他汀还通过显着减少肝胶原沉积和羟脯氨酸含量来改善肝纤维化（图 7E）。通过 16S rRNA 基因测序对在阿托伐他汀治疗 (HFHC+At) 下喂食 HFHC 的小鼠的粪便进行微生物群分析，并与喂食 NC、HFLC 和 HFHC 的小鼠进行比较。抗胆固醇阿托伐他汀治疗显着恢复了喂食 HFHC 的小鼠的细菌丰富度（图 7F）。

此外，在 HFHC 喂养小鼠的失调 OTU 中（图 4B 和 D)，发现Mucispirillum schaedleri_Otu038、Desulfovibrio_Otu047、Anaerotruncus_Otu107和Desulfovibrionaceae_Otu073的丰度被抗胆固醇处理逆转（图 7F）。为了研究微生物群在抗胆固醇药物预防的 NAFLD-HCC 中的直接作用，我们将 HFHC+At 小鼠的粪便灌胃给无菌小鼠（G-HFHCat，n=10）。与 G-HFHC 组相比，G-HFHCat 小鼠在灌胃后 14 个月表现出肝脏组织学改善，肝脏甘油三酯和脂质过氧化降低（图 7G）。在用阿托伐他汀治疗的 HFHC 小鼠中观察到 IPA 的诱导和 TCA 的减少。这些结果进一步表明，肠道微生物群在介导胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 中发挥着积极作用。

图7 | 胆固醇抑制消除了 HFHC 喂养小鼠的 NAFLD-HCC 进展

a)喂食 HFHC 饮食的 C57BL/6 小鼠的阿托伐他汀治疗示意图。

b)用或不用阿托伐他汀治疗的 H&E 染色 HFHC 喂养的小鼠肝脏的代表性总体形态和显微特征，计算脂肪变性、炎症和胶原蛋白的组织学评分。

c)血清胆固醇水平、肝脏游离胆固醇水平、血清 AFP 水平

d)血清 ALT 水平、肝脏 NAD+ 与 NADH 比率、肝脏 SOD 活性、血清 IL-6、IL-1α、IL-1β、MCP-1、在接受或不接受阿托伐他汀治疗的 HFHC 喂养小鼠中，MIP-1α、MCP-1β 蛋白水平、

e)胶原沉积和羟脯氨酸含量。

f)用或不用阿托伐他汀治疗的 NC、HFLC 和 HFHC 喂养的小鼠粪便中细菌的细菌丰富度和热图图。

g)HFHCat 粪便灌胃无菌小鼠 (G-HFHCat) 中肝脏的大体形态、组织学检查、甘油三酯和脂质过氧化

h)胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 发展机制示意图

研究讨论

尽管胆固醇在 NASH 中是一种已知的细胞毒性脂质，关于胆固醇在 NASH 引起的 HCC 发展中的作用和重要机制的信息是有限的。在这项研究中，我们首次证明长期高膳食胆固醇喂养会导致小鼠自发性 NAFLD-HCC 发展。我们研究了高膳食胆固醇从 NAFLD 发展为 HCC 的主要机制。我们发现喂食高胆固醇饮食的小鼠在 NAFLD-HCC 中 ROS 积累增加。积累的 ROS 是一种有毒介质，可诱导炎症反应、胰岛素抵抗和氧化损伤。事实上，我们的分析表明，膳食胆固醇会诱导 ROS 和促炎细胞因子，从而促进 NASH 和 HCC 的发展。我们的研究结果为肠道菌群失调在胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 进展中的潜在作用提供了新的见解。除了肠道菌群失调外，共生细菌产生的小分子代谢物也可能导致 NAFLD 的发病。我们的研究结果表明，胆固醇可能会损害胆汁酸代谢和微生物色氨酸代谢，导致血清 TCA 升高，IPA 降低，从而促进 NAFLD-HCC 的发展。阿托伐他汀治疗的 HFHC 喂养小鼠的粪便不会促进受体无菌小鼠的肝细胞增殖。这些观察结果进一步强调了阿托伐他汀在预防胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 发展中的潜在用途。

小鹿推荐

这项研究首次表明，长期高膳食胆固醇通过调节肠道微生物群诱导雄性小鼠自发和进行性发展为 NAFLD-HCC。胆固醇通过肠道菌群改变诱导 TCA 增加和 IPA 减少，从而促进肝脏中的脂质积累和细胞增殖，导致 NAFLD-HCC 发展。抗胆固醇治疗完全消除了膳食胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 形成。这项研究强调了胆固醇抑制和对肠道微生物群及其相关代谢物的控制可能是预防 NAFLD-HCC 的有效策略。

文末看点｜lumingbio

欧易/鹿明生物推出的16s+代谢组学的多层组学研究思路继本篇文章前已先后助力了浙江工业大学、中国农科院、青岛农业大学等在微生物一区顶刊Microbiome、医学一区顶刊GUT发表文章。

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项目文章PBP | 浙江工业大学傅正伟运用GC-MS非靶向代谢组学和16S探究水稻根际微生物群落影响