项目文章 | 孙建腾教授团队运用GC-MS非靶向代谢组学探究有机磷阻燃剂对生物生长发育的毒理机制

在指定剂量的TCEP和TPHP处理下，大肠杆菌中SOD和CAT活性的变化见图2。在低剂量的TCEP和TPHP(10μM)处理24h后，SOD和CAT活动轻微被抑制，而在更高剂量的治疗组48h(25和50μM)处理后显著被抑制。大肠杆菌对TCEP和TPHP胁迫下SOD和CAT活性的变化基本相同，表明这两种酶对抗氧化应激存在协同作用。从这个意义上说，作者推断SOD首先被触发分解O_²⁻，同时促进CAT活性将过氧化氢分解为水和O₂。在之前发表的研究中，短短芽孢杆菌暴露于TPHP后的SOD和CAT活性均增加，表明这些抗氧化酶可能削弱TPHP诱导的抑制作用。

图2| TCEP和TPHP对不同水平TCEP和TPHP处理的大肠杆菌SOD和CAT活性水平的影响

MDA是脂质过氧化的主要成分，从图3所示的MDA结果来看，其基本趋势与SOD和CAT结果相似，不同剂量TCEP和TPHP处理24h后MDA含量略有升高，但在高剂量TCEP和TPHP处理48h后明显上升。如图3b所示，在10、25、50μM作用48h后，MDA含量分别升高了53.7%、71.1%、84.8%、60.9%、85.0%和88.3%(p<0.05)。在相同的暴露条件下，TPHP诱导的MDA水平的升高比仍高于TCEP，这与ROS的结果吻合较好。

图3| 不同浓度的TCEP和TPHP处理后的大肠杆菌中MDA水平

程序性细胞死亡(PCD)的过程是细胞凋亡，其特征是DNA碎片化和膜去极化，被解释为外源性物质诱导氧化应激的另一个关键指标。采用AnnexinV-FITC/PI检测细胞早期凋亡和完整的细胞膜，或晚期凋亡（或坏死）导致细胞膜完整性的丧失。凋亡的变化趋势和活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞四种细胞分布分别如图4a和b所示。暴露24和48h后，TCEP和TPHP可显著诱导细胞凋亡，且呈剂量和时间依赖性。

图4| TCEP和TPHP暴露对大肠杆菌细胞凋亡的影响

Na⁺/K^+-ATPase(NKA)是一种跨膜酶，负责将Na⁺和K⁺离子跨细胞膜运输，在渗透调节中起着至关重要的作用，被广泛用作有毒环境中细胞活性的生物指标。NKA受体，被认为是一个离子泵，不仅维持细胞膜电位，细胞离子稳态，细胞体积和钙浓度也参与各种蛋白质相互作用，激活蛋白质级联和参与调节信号转导，如Ca²⁺信号转导和氧生成。

我们测定了Na⁺/K^+-ATPase(Na⁺泵)和Ca²⁺/Mg^2+-ATPase(Ca²⁺泵)的活性，两种酶活性均呈剂量和时间依赖性的下降趋势。TCEP和TPHP在10、25和50μM处理24h后，其活性有轻微抑制。Na⁺泵和Ca²⁺泵水平下降，14.9–33.7%和20.1–32.4%。然而，如图5b和d所示，在较高剂量的TCEP和TPHP作用48h后，Na⁺/K^+-ATP酶和Ca²⁺/Mg^2+-ATP酶的活性显著升高。

图5| TCEP和TPHP暴露下大肠杆菌Na⁺/K^+-ATP酶和Ca²⁺/Mg^2+-ATP酶水平的影响

通过GC-MC非靶向代谢组学对差异表达的代谢物进行了筛选和鉴定，发现共有70种代谢物显著差异表达。其中在最高浓度暴露48h后，TCEP诱导大肠杆菌中有6个上调和64个下调代谢物的合成，而TPHP暴露48h后触发4个上调和88个下调代谢物。大部分呈下调趋势的代谢物参与丙酮酸代谢、磷酸戊糖代谢、不饱和脂肪酸生物合成、氧化磷酸化、核糖体代谢、嘌呤代谢和氨基酸生物合成。大肠杆菌的差异调控代谢网络如图6b所示。在TCEP和TPHP处理组中，分别只有6种和4种代谢物在TCEP and TPHP处理后同时表达。

处理后同时上调

图6| 由TCEP和TPHP触发的代谢物表达和代谢途径及富集细胞代谢的差异调控网络。