Nature Immunology IF 25 | 这种分析你也能用！轨迹推断揭示心脏巨噬细胞和单核细胞的分化

2022-03-21 17:12:12, HHY 上海吉凯基因医学科技股份有限公司

单细胞测序使我们在一个极高分辨率水平探索生物过程成为可能。单独探索某一个细胞意义不大，但如果我们可以将单个细胞按照生物发展过程（如细胞分化）排序，则能使人们了解不同细胞在该过程扮演的角色。

细胞轨迹推断可轻松实现以上目标，且该分析方式已得到了普遍认可。这里小编提出一些已经被轨迹推断回答的问题，供我们的读者发散。

1. 肾脏集合管的主细胞和夹层细胞在分化上有何关系，是否存在过渡细胞？

2. 肿瘤浸润性T细胞是如何分化的，该分化过程的各阶段对应了怎样的细胞特征？

3. 脑中的增殖区相关小胶质细胞是如何发育而来的，该细胞与退行性疾病相关的小胶质细胞在基因表达上有何共同点？

多伦多综合医院研究所的研究人员利用Monocle2（轨迹推断的一种算法），探索了多种巨噬细胞和单核细胞的分化，对Monocle2各项功能进行了几乎模范式的应用，但Monocle2可用于各种细胞类型，绝不仅限于巨噬细胞，因此这里小编利用该篇文章，对轨迹推断部分着重分析，希望能给我们的读者提供一些科研上的思路。

缺血性心血管疾病在全世界范围内仍是死亡的主要原因。心肌梗死后，炎症反应被引向损伤部位，导致结构和生化变化，可导致不良的心脏重塑和功能障碍，临床上表现为心力衰竭。巨噬细胞是专门的单核吞噬细胞，在对损伤的反应中很重要。组织损伤后，CCR2+单核细胞和巨噬细胞可以产生IL-1β，一种促进心血管疾病的炎症细胞因子。

因此，巨噬细胞和单核细胞对损伤修护的重要性不言而喻，作者在这片文章中对这些细胞的分化进行了探索，但轨迹分析开始之前，有必要先进行细胞注释、差异分析和富集分析，使轨迹分析的结果更容易解释。

心脏含有传统树突状细胞，它们可以表达巨噬细胞标志物。为了描述单核吞噬细胞的异质性，作者将小鼠心脏的巨噬细胞和树突状细胞按1:1的比例汇集在一起，然后对这1780个细胞测序，降维聚类分析确定了11个主要巨噬细胞和树突状细胞集群。其中，4个是巨噬细胞集群（集群1、2、3和5），1个是单核细胞集群（集群4）。

巨噬细胞集群中：

集群1表达Timd4、Lyve1和Igf1等基因，是转录最独特的（称为Timd4集群；图1d），其pathway主要集中在稳态和再生功能上，即内吞作用、溶酶体、血管生成和再生（图1e）
集群2表达相对较高的抗原呈递基因，与CCR2-MHC-IIhi巨噬细胞相关（称为Mhc-II群），强烈上调翻译-核糖体途径
集群3为CCR2+巨噬细胞（称为Ccr2群），同样上调翻译-核糖体途径，富集经典的炎症途径，包括呼吸爆发、对IL-12、IFN-γ和I型干扰素的反应
集群5富含许多干扰素刺激的基因（ISG），如Irf7、Isg20和Ifit1（称为Isg群；图1b,d），上调翻译-核糖体途径，同样富集经典的炎症途径。

图1：a) 对巨噬细胞和DCs细胞进行细胞分群并注释的结果，每个点代表一个细胞，空间上距离更近的细胞具有更相似的基因表达模式

b) 图a每个聚类中差异表达最大的65个基因的热图，横列代表细胞，属于不同的细胞类型，纵列代表差异基因

c) 描述单个基因的单细胞基因表达的特征图

d) 聚类定义基因的小提琴图（聚类1-5）

e) 使用gProfiler将Timd4聚类中差异表达的基因与Mhc-II聚类、Ccr2聚类和Isg聚类进行比较

基于以上结果即可进行拟时序分析。为了确定单核细胞和巨噬细胞集群之间是否存在假设的发展关系，作者对他们重新分组（图2a），并将分群结果叠加在伪时间轨迹上。分析表明Timd4集群中的巨噬细胞占据了一个单独的轨迹分支（图2b）。在Ccr2和Isg群中发现的单核细胞和巨噬细胞占据了第二个分支（图2b），而Mhc-II群中的巨噬细胞跨过了所有三个分支（图2b）。Mpath算法显示了类似的排序，并表明Isg簇中的巨噬细胞可能来自Ccr2簇，而不是单核细胞（图2c），可被限制性Monocle分析所证实（图2d）。

然后利用Monocle把基因表达作为拟时间的函数来绘制，以跟踪不同巨噬细胞状态的变化。Klf2、Mafb和Maf在Ccr2群中表达较低，在Mhc-II群中较高，在Timd4群中进一步增加（图2e,f），表明这些转录因子与心脏巨噬细胞的命运有关。MHC-II丢失的基因，Cx3cr1和Il1b与Timd4、Lyve1和Igf1在Timd4簇中的表达增加有关（图2e,f），这是转录最明显的子集。相比之下，Ccr2、Mhc-II和Isg集群似乎是一个相关系谱，Isg集群采取了独特的激活状态，集中在I型IFN信号的周围。追踪不同巨噬细胞状态下的基因表达变化显示了，定义巨噬细胞亚群和功能的协调模式。

图2：a) 对1-5群（Timd4、Mhc-II、Ccr2、Isg和单核细胞）的细胞重新聚类。每个点代表一个细胞，相对位置较近的细胞具有相近的表达模式，基于细胞所属类型为细胞着色，使用Monocle（b）和Mpath（c）算法，基于集群之间的差异表达基因构建巨噬细胞和单核细胞之间的进化关系

b）B1、B2、B3代表分化的方向，端点代表分化的起始点或终点，每个点代表一个细胞，并基于细胞类型着色，空间上相近的细胞在分化关系上更近

d) 只包括单核细胞群、Ccr2群和Isg群的轨迹分析，每个点代表一个细胞，并基于细胞类型着色，相近的细胞在分化关系上更近

e) 差异表达基因（纵列）的热图，按照Monocle定义的伪时间（横列）排序，这些基因可能是驱动细胞分化的关键基因

f) 横轴为伪时间，纵轴为基因表达量，与细胞分类对应的颜色叠加绘制

【参考文献】

1. Park, J., Shrestha, R., Qiu, C., Kondo, A., Huang, S., Werth, M., ... & Suszták, K. (2018). Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease. Science, 360(6390), 758-763.

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6. Xiaojie Qiu, Andrew Hill, Cole Trapnell et al (2017): Single-cell mRNA quantification and differential analysis with Census. Nature Methods

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