【液体吸光度测量】典型配置、硬件说明、软件操作

A_λ=波长λ 处样品的吸光度； 

𝑆_𝜆=波长λ处样品光谱的强度； 

𝐷_𝜆=波长λ处背景光谱的强度； 

朗伯比尔定律描述了浓度与吸光度的关系：

𝐴_𝜆 = 𝜀_𝜆cl

𝜀_𝜆=波长λ 处样品的消光系数；c=样品的浓度；l=吸收光程；

液体吸光度测量的典型系统配置包括：光谱仪操作软件、光谱仪、计算机、光源、光纤、比色皿和支架。

图1 液体吸光度测量系统典型配置图

表1 典型系统配置▼

【HL -2000 光源介绍】

光源的基本操作步骤：

• 启动光源，预热 10 分钟，以达到稳定状态；

• 光纤与光源连接后，可通过转动调节光阑旋钮控制光强；

• 如果用户在实验操作中对光源的输出光谱有特殊要求，可在插片凹槽处放置滤光片、衰减片等光学器件。

图2 HL-2000-FHSA 光源实物图

图 3 一次性比色皿

图4 石英比色皿

图 5 CUV-UV 比色皿支架

图 6 CUV-UV-10 比色皿支架

此外，海洋光学还提供 CUV-VAR 型可变光程的比色皿架，可调节光程范围为 1-10cm， 内置的准直镜固定在支架上，支架可在基座上滑动，CUV-VAR 适用于需改变光程的液体的吸光度测量。

图7 CUV-ALL-UV 4-WAY 比色皿支架

图8 CUV-FL-DA 直连比色皿支架

图9 CUV-VAR 可变光程比色皿架

图10 CUV-QPOD 可控温比色皿支架

• 将比色皿放置在CUV-ALL-UV 4-WAY 比色皿支架的夹具中，支架内配有可调弹簧活塞，用来固定比色皿。比色皿支架有一个内置的滤光片插槽，我们将连接光源的光纤引入靠近插槽一侧的连接口。可将滤光片放置于插槽中，进行吸光度测量。
• 两根光纤连接比色皿支架时，若两端呈现 90°，则用于测量样品的荧光；若两端呈 180°，则用于测量样品的吸光度。可根据具体要求连接光纤与比色皿支架。
• 比色皿支架的底部有隐藏管道，可连接外部水源，以控制比色皿内样品温度。如下面实物图所示，支架底座可见 3 个出/入水口，出/入水口前的白色旋钮可拆卸，使用时请根据需求卸下。将通道口连接附件，附件的另一侧连接水管，用户可选择两进一出或两出一进模式。需要注意的是，用户需要将将出水口管道一侧接入水泵。

图11 CUV-ALL-UV 4-WAY 比色皿支架实物图

图12 连接附件

搭建液体吸光度测量系统，具体操作步骤如下：

1）使用一根光纤连接比色皿支架与光谱仪，另一根光纤连接比色皿支架与光源，注意两端光纤呈 180°（如图14 所示）；

2） 通过USB 数据线连接光谱仪至PC 端；

3）用电源线连接光源和市电插座（注意选择带地线的国标电源线和市电插座）；

4） 打开光源，预热一段时间后，在空比色皿中装入纯水，测量参考光谱；

5）切断光路（此处不建议直接关闭光源，可通过遮挡光源来切断光路），测量背景光谱；

6）恢复光路，将样品装入空比色皿，进行样品的吸光度测量。

图17 Flame 光谱仪接口说明

注意：吸光度测量时，遮光罩应始终放置在样品上方，排除环境光的干扰。

本部分介绍吸光度测量的软件操作流程，具体操作步骤如下：

1）从欢迎界面或者点击图标创建新的光谱应用，在光谱应用向导中点击吸光度向导图标。

2）出现“选择浓度模型”窗口，点击“仅吸光度”选项，其他两项见文档最后的补充介绍。

• 仅吸光度：测量液体或气体样品的吸光度。

• 朗伯比尔定律：适用于测量未知浓度的样品，在吸光度测量的基础上，输入样品的消光系数和光程，利用朗伯比尔定律 𝐴_𝜆 = 𝜀_𝜆cl，得到样品的浓度。 

• 从已知浓度的溶液校准：如果用户已经测得样品在几组不同浓度情况下的吸光度，输入吸光度与浓度的数据后，软件可将数据点进行曲线拟合。当用户再次测量未知浓度的同一样品时，软件将根据样品的吸光度和前期数据拟合 的曲线，计算得到样品的浓度。

3）调整好硬件配置后，在软件中设置数据采集参数，包括积分时间(integration time)、平均次数(average)和滑动平均(boxcar)。用户可根据光源的强度，调节积分时间和平均次数等参数，勾选 “暗噪声校准”和“非线性校准”功能。注意参考 谱测量和样品测量时的参数设置应相同。设置完成，光谱将显示在右侧谱图界 面，点击“下一步”按钮。 

• 积分时间：积分时间是检测器在将累积的电荷通过A/D转换器加工之前，被允许收集光子的时间长度。最小积分时间是设备支持的最短积分时间，它取决于检测器读出所有像素信息的快慢，积分时间 与数据传输速度是不同的概念。

• 平均次数：光谱被显示到软件里之前会采集多次，然后取平均。

• 滑动平均：平滑是一种可以应用于光谱的空间平均。该过程通过平均相邻像素点的值来消除噪声，因此它会以牺牲光学分辨率为代价来提高信噪比。空间平均在光谱相对平坦以及相近像元变化较小的情 况下使用是非常有效的，但由此产生是分辨率的损失会使得尖锐的光谱特征峰难以分辨。当应用空间 平均时，信噪比会以像元平均的平方根为基数进行提高。请注意，在海洋光学软件中，平滑宽度的值 是指所有像元以中间为基准靠左或靠右的像元和的平均数。平滑值是4实际上是将9个像元一起平均（4个靠左像元+1个中心像元+4个靠右像元），信噪比将以3为倍数增加。同样的，平滑值是2（5个 像元）将使信噪比以2.2为倍数增加，平滑值是0（1个像元），信噪比以1为倍数增加（因此光谱不改 变）。

• 暗噪声校准：海洋光学的大部分光谱仪都有自带的遮光像元。暗噪声校准会用当前光谱读数减去遮光 像元的读书，以排除温飘等系统性影响。

• 非线性校准：光谱仪出厂前已完成。如无特殊需求，请默认勾选。

• 触发模式：请参考海洋网站的相关文档。如无特殊需求，可保持默认设置不变。 

4）出现“保存参考光谱”窗口，点击图标保存参考光谱，再点击“下一步”。

5）出现“保存背景光谱”窗口，点击图标按钮，保存背景光谱。之后点击“完成”按钮完成设置。

6）在视图窗口中，吸光度测量结果以两张图谱的形式显示。如下图所示，左侧为吸光度图谱，右侧为光谱全谱，图谱结果均实时更新。点击 “以表格形式查看 结果”，即可查看图谱的数据表，表中的数据可复制后粘贴到Excel 或 txt。

 : 单步采集光谱数据，单次采集后停止，点击运行，可继续采集。

 : 暂停采集光谱数据，终结采集过程。 

b） 点击图标进行数据保存的设置，包括数据保存格式、路径、保存方式等。点击“应用”按钮确认配置，之后点击“退出”按钮关闭对话框。

c） 点击启动设置，该按钮变红，表明保存工作正在进行。如果需要停止保存，请再次点击该按钮至恢复原样；

d） 也可以点击按钮，将全谱数据保存到电脑剪贴板，然后将数据直接粘贴 到Excel 或 txt。