相变即质变—近十年来细胞生物学家在关注什么？

2022-02-28 16:12:18, OLYMPUS生命科学仪景通光学科技（上海）有限公司

本文作者：Norman

“ 鸿蒙初始，盘古开天辟地，

清者上升为天，浊者下沉为地。”

相分离的开端

当 David Courson 和 Lindsay Moore 到达美国马萨诸塞州伍兹霍尔实验室时，他们的期待仅仅是通过这次暑期科研项目的机会，学习使用高端显微镜等新技术。作为研究生，他们从未想过这次旅程竟然帮助解决一个困扰生物学家长达25 年的难题。

导师交给他们的任务是观察线虫卵中RNA和蛋白分子构成的小球（P颗粒）是如何形成的。这些结构多变的小球的构成一直困扰着生物学家，然而在显微镜下，Courson、Moore和他们的导师发现了一个非同寻常的现象：P颗粒像熔岩灯里的液滴一样相互碰撞、融合。

艺术家笔下的细胞油滴

和固相物质不同，这是液体之间才有的现象。他们突然意识到，P颗粒并非固体核心，而像油醋调味瓶里的液滴，剧烈摇晃之后分散成很小的液滴，又很快地融合成大液滴。

他们的导师Anthony A. Hyman和他的博后Cliff Brangwynne回到德国马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所（MPI-CBG）后，开展了进一步的实验。他们将充满P颗粒的线虫性腺放置在两片薄玻璃中间，随后迅速将两片玻璃平行移动。在切力作用下，固体成分被涂抹开，但P颗粒相互融合、散落，正如伞上的雨滴。

这表明：通过“相分离”，可以让细胞内的特定分子聚集起来，从而在“混乱的”细胞内部形成一定“秩序”。这项研究被发表在2009年6月的Science杂志上，并开始了生物相变/相分离研究的新篇章。

相分离研究的发展

近年来大量的生物相变/相分离研究相继涌现，相关的研究文章、综述在各大期刊上呈现逐年上升的趋势，成为了细胞生物学研究的一大热点。

近10年CellPress和Nature期刊关于生物相分离的研究文章发表趋势

生物相变/相分离事件在全球科研团队的研究中被证实至少有如下七类生物学作用。

生物感知：感应环境的微小变化，触发相分离过程的速率比转录翻译更快

触发反应：增加局部的分子浓度从而触发生化反应

抑制反应：通过局部分子隔离从而抑制生化反应

缓冲：形成局部的分子池，可在需要增加分子浓度时对外输送，或在外界分子浓度饱和时进行回收存储

分子定位：由于相分离过程本身具有选择性，可让特定分子在本地留存

做功：某些液滴具有粘弹性的特点，因此凝聚过程可以对外提供能量并做功

过滤：液滴中的分子疏松交联产生的孔状结构甚至可以作为生物分子的过滤器。这在核孔中已经得到了证实。

生物相分离研究的工作流

经典的生物相分离研究通常包括以下的研究步骤：

在相分离研究中，第一步往往是确定细胞内某现象有相分离事件的参与。在该步骤中，研究人员在收集细胞内相分离液滴后，通过使用物理方法（如降温、添加PEG孵育等）在光学显微镜下观察凝聚液滴的外观形态、融合过程。为了证明液滴与周遭环境的物质交换，活细胞荧光漂白后恢复（FRAP）观察是一个必要的验证方法。

研究的第二步往往根据课题的目的展现出研究方法的多样性，常见的思路包括：相分离事件对细胞的影响或者重现致病过程等。在此步骤中，除了对液滴本身的精细观察，还需要以更高的空间分辨率、时间分辨率的手段观察细胞或更大的生物组织结构变化。

研究的第三步常涉及到相分离事件的调控机制、关键分子的确定等开展更深入的研究，并能较明确地给出研究的生物学意义。常见的研究思路包括信号通路研究、大通量蛋白图谱和蛋白组、转录组学研究等。

相分离研究显微解决方案

荧光漂白后恢复（FRAP）实验可观测液滴与周边环境存在动态交互过程，因此常见用于从侧面确认相分离现象的发生。另外，在液滴内部、液滴外部环境、液滴的边界进行FRAP实验可以获得大量动力学属性数据（如分解速率、融合速率等）。

OLYMPUS全电动倒置显微镜 IXplore Pro 配合高精度光刺激模块 cellFRAP 适合进行生物相分离实验的第一步——提供全倍率下优质的荧光和DIC成像效果，而cellFRAP实时同步光操控模块拥有独立的高精度扫描振镜，可在显微镜成像过程中独立对精细区域进行光刺激。

进一步的生物相分离研究需要观察活体/细胞内的现象，因此需要更高的时空分辨率。OLYMPUS激光扫描共聚焦显微镜FV3000是一套集高灵敏度、高分辨率和操作简便于一体的共聚焦系统，非常适合进行FRAP实验。特别是搭载了独有的龙卷风光刺激功能，可对目标进行更精准、更高效的光漂白。

如果液滴运动较快，IXplore SpinSR转盘共聚焦 与 cellFRAP 的组合则是更佳的选择。该系统提供极快的成像速度、高达110nm分辨率，同时完全兼容Click and Bleach 模式，即使时刻处于移动中的液滴也可以被精准地漂白。

配合高速Z-Stack拍摄，还可以极大缓解由于液滴在Z方向运动导致的亮度降低，最终获得平滑的荧光漂白后恢复亮度曲线。

使用cell^FRAP模块进行光漂白，配合Z-Stack获得平滑的FRAP曲线

如果想要观察的目标/液滴位于细胞膜，IXplore TIRF全内反射荧光显微镜将是首选。IXplore TIRF 比共聚焦系统更出色的Z轴分辨率，轴向分辨率可控制在50-200nm内，非常适合对活细胞进行细胞膜的观察。仪器完全兼容Click and Bleach模式，从而对细胞膜上快速移动的目标进行精准的漂白。

相分离研究案例

为更好地让您了解相分离的应用实例，我们特别邀请了上海交通大学管彬博士，以线上报告的形式分享他以第一作者在Science Bulletin上发表的研究工作，揭示相分离参与调控细胞自噬的分子机制。

报告题目：Arabidopsis AUTOPHAGY-RELATED3 (ATG3) facilitates the liquid–liquid phase separation of ATG8e to promote autophagy.

报告时间：2022年3月10日15:10-15:55

报告嘉宾：管彬博士

上海交通大学农业与生物学院，薛红卫教授课题组，博士后研究员

毕业于中国科学院分子植物科学卓越创新中心，主要从事磷脂分子和细胞自噬方向的研究。

近年来以第一作者在Science Bulletin，Frontiers in Plant Science发表研究论文，分别揭示相分离参与调控细胞自噬的分子机制，和淹水胁迫下细胞自噬与程序性细胞死亡的关系。

另外，博士期间研究的磷脂分子参与调控细胞自噬的分子机制的研究论文即将发表。

这个报告只是OBIC（Olympus Bio-Imaging Conference）中的一个亮点。

为期三天的研讨会，Olympus邀请了来自世界不同地区多个领域顶尖专家，将于2022年3月9日-11日，以线上论坛形式，共同探索光学显微镜及生物成像技术的新维度（点击了解OBIC）。

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参考文献：

Dolgin, Elie. “What Lava Lamps and Vinaigrette Can Teach Us about Cell Biology.” Nature, vol. 555, no. 7696, 2018, pp. 300–302.

Dolgin, Elie. “What lava lamps and vinaigrette can teach us about cell biology.” Nature vol. 555,7696 (2018): 300-302. doi:10.1038/d41586-018-03070-2

Nott, Timothy J et al. “Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles.” Molecular cell vol. 57,5 (2015): 936-947. doi:10.1016/j.molcel.2015.01.013

Alberti, Simon et al. “Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates.” Cell vol. 176,3 (2019): 419-434. doi:10.1016/j.cell.2018.12.035

Zhang, Hong et al. “Liquid-liquid phase separation in biology: mechanisms, physiological functions and human diseases.” Science China. Life sciences vol. 63,7 (2020): 953-985. doi:10.1007/s11427-020-1702-x

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