简便上手 | 利用Excel和小工具完成FC/p/VIP值计算

差异代谢物筛选方式及利用Excel完成计算的方法

(1)定义：根据代谢物的相对定量或绝对定量结果，计算某个代谢物在两组间表达量的差异倍数（Fold Change），简称FC值；

(2)计算方式：A物质在对照组中的定量结果为1，在处理组中定量结果为3，那么此物质的FC值即为3；

(3)筛选标准：默认选择FC≥2/FC≤0.5，可调整为FC≥1.5/FC≤0.8或FC≥1.2/FC≤0.67。

① 从结果Excel结果中复制出物质及对应的定量结果。

② 在每一组后面插入一列，计算每组的平均值，使用Excel中平均值函数“Avg”进行计算。

③ 对两组之间的平均值进行相除计算：例如A vs B，使用B average/A average进行相除得到的结果就是FC值。

(1)定义：又称student t检验（Student’s t test），是一种常用的假设检验方法；

(2)运算规则：首先必须要有假设，我们假设某个代谢物在A组和B组中含量没有差异（H0，零假设），然后基于此假设，通过t test计算出统计量t值和其对应的p值，如果p-Value<0.05，那么说明小概率事件出现了，我们应该拒绝零假设，即A组和B组的含量不一样，即有显著差异；

(3)筛选标准：默认选择p<0.05，可调整为p<0.01或p<0.001（更加严格）。

① Excel表格中选择“公式”后，选择“常用函数”，选择“TTEST”（如果没有该函数，可以选择“插入函数”进行查找即可）。

② 选择函数后，输入“第一组数值”、“第二组数值”、“尾数”、“类型”4个内容，点击“确定”，即可输出结果。

第一组数值：A组数据集（A组相对含量）

第二组数值：B组数据集（B组相对含量）

a.尾数：如何确定是“单尾”还是“双尾”

单尾：知道方向性，例如A变量已经大于B变量，但是不知道大多少；

双尾：不知道方向性（到底是A大于B还是B大于A）。

严格的统计分析来说要求双尾更多一些，有两组数据A和B，双尾显著性检验就是比较A和B有无显著性差异，单尾检验就是检验：A是否显著大于B或者B是否显著大于A，至于方向，一般是在假设的时候定，或者题目中的提问就有（请检验**是否显著大于/小于**）。

b.Type：如何确定类型

对于T检验时，当为双独立样本时，须先进行方差齐性判断，用FTEST()函数：P=FTEST()，直接看P是否<0.05或<0.01，判断显著性。当p<0.05或<0.01时，说明“两组数据的方差有统计学意义上的显著性差异”，即两个样本空间的方差“不齐”，这时T检验种的TYPE参数应取3。反之，说明“两组数据的方差无统计学意义上的显著性差异”，即两个样本空间的方差“齐”，这时，T检验中的TYPE参数应取2。

(1)定义：OPLS-DA分析是一种具有监督模式识别的多元统计分析方法，能够有效的剔除与研究无关的影响从而筛选差异代谢物。OPLS-DA常用来做两组之间的对比，也可以用于三组对比，但是出具的图形会比较难看，所以一般建议使用两组进行对比来进行筛选。

(2)筛选标准：默认筛选VIP>1，少数情况下可进行调整为VIP>0.8.

① 准备好要进行计算的两组定量数据和样品信息表格，使用txt格式进行保存；

代谢物定量信息 txt

样品信息 txt

② 在云平台上选择工具“高级OPLS-DA分析”，将准备好的文件上传到云平台上，对于参数的调整包括三个部分：对数转换参数-可选择进行对数转换和不进行对数转换；归一化参数-“center”、“pareto”“standard”可以任选一种，目前默认的是“center”，公式为x - μ，该方法将原始数据转化成离原点更近的数据，调节代谢物浓度高低差异；Pareto公式为(x - μ) / sqrt(σ)，该方法更接近原始测量数据，但是对变化倍数大的变量更加敏感；standard：公式为(x - μ) / σ，该方法将消除不同代谢物浓度数量级的差别，使所有变量拥有同等的重要性，但是检测误差可能会变大。

③ 计算完成后即可下载对应的图以及相应的结果文件，也可以通过绘制工具对图形进行修改。

输出结果：

到此，我们筛选差异代谢物的三种方法就介绍完了，在选择其中两种进行筛选时，直接将数值汇总到一个表格中后，进行两步筛选即可。

① 筛选VIP>1的代谢物

②　筛选FC>2+FC<0.5的代谢物

③　筛选结果

接下来，我们只要针对这些物质进行VIP值大小进行排序后，对物质功能进行分析即可。

本次主要分享在筛选差异代谢物的方式及如何利用最简单的工具达到目的，下一期，我们会分享一下KEGG网站的使用，敬请期待。