Nature子刊 | 转录组+蛋白质组等技术揭示乳腺癌中Top基因介导的晚期核内体形成及Wnt/β-catenin信号转导机制

INPP4B是与ER+乳腺癌和肿瘤分级相关的top基因，在三阴性(ER-/PR-/HER2-)和基底样乳腺癌中表现出抑癌活性。今年5月Nature communications杂志上“INPP4B promotes PI3Kα-dependent late endosome  formation and Wnt/β-catenin signaling in breast  cancer”这项研究进一步探索了INPP4B在PIK3CA突变的ER+乳腺癌中的作用，利用蛋白质组学、转录组学和细胞成像的综合方法，阐明了INPP4B促进PIK3CA突变ER+乳腺癌发生的分子机制。

通过免疫组化检测两个独立的组织队列的INPP4B蛋白的表达。US Biomax队列包含224例原发性人类乳腺癌和32例瘤旁正常乳腺组织，另一组队列是墨尔本协作队列研究(MCCS)的一部分,包含107例原发性乳腺癌。研究发现，INPP4B表达减少与三阴性乳腺癌相关，但14-40%的ER / PR阳性和管腔型(ER+和/或PR+)乳腺癌亚型中观察到INPP4B蛋白表达的增加，并通过OriGene技术检测130例原发性人类乳腺癌和16例正常乳腺组织的INPP4B mRNA表达水平得到进一步确证。INPP4B mRNA表达与PTEN和AKT1突变无关，但与PIK3CA突变正相关。进一步分层显示，INPP4B高表达与PIK3CA突变的ER+乳腺癌亚群特异性相关。

为了确定在PIK3CA突变ER+乳腺癌中INPP4B表达增加的功能结果，研究团队分别在PIK3CAE545K和PIK3CAH1047R突变的MCF-7和T47D ER+乳腺癌细胞中表达了GFP-INPP4B，同时采用3D培养的方法在MCF-10A细胞上过表达PIK3CAWT/Myc-INPP4BWT和PIK3CAWT/Myc-INPP4BC842A研究INPP4B对细胞形态的影响，研究表明INPP4B增强PIK3CA突变ER+乳腺癌和乳腺上皮细胞增殖。

蛋白组学分析INPP4B在PIK3CA突变ER+乳腺癌的下游功能，确定GFP-INPP4B与gfp载体表达MCF-7细胞中蛋白水平的差异，上调蛋白主要与溶酶体系统相关，包括负责囊泡运输，以及介导细胞外受体和物质的内化降解。免疫沉淀质谱(IP-MS)鉴定出与INPP4B最富集结合伙伴是RAB7A (Rab7)。Rab7提高INPP4B的磷酸化水平，INPP4B提高胞内PI(3)P的产量。在MCF-7细胞上敲除INPP4B，PI(3,4)P2的量增多，PI(3)P的量减少，证明INPP4B促进晚期核内体上PI(3,4)P2转变为PI(3)P。

内膜PI(3)P信号对于早期核内体融合、早到晚核内体成熟和物质分选至关重要。MCF-7细胞内溶酶体室检测显示GFP-INPP4B未影响EEA1阳性早期核内体，但显著增加CD63阳性晚期核内体(2.5倍)和LAMP1阳性溶酶体(1.7倍)，提示INPP4B促进晚期核内体/溶酶体的形成。泛I类PI3K抑制剂BKM120、PI3Kα特异性抑制剂BYL719或使用两种不同的siRNAs耗尽PIK3CA抑制GFP-INPP4B细胞中晚期核内体形成的增加，表明INPP4B促进PI3Kα依赖的晚期核内体形成。

PI(3)P信号通过招募Hrs（ESCRT家族）调控晚期核内体形成。敲除Hrs，会抑制Hela细胞及其CDX模型肿瘤的增殖。恢复Hrs后，与非过表达INPP4B细胞相比，INPP4B过表达细胞晚期核内体形成增加。电镜也观察到了同样的结果。表明INPP4B在PI(3)P驱动的Hrs调控的晚期核内体形成中发挥重要作用。将过表达INPP4B的MCF7细胞接种BALB\\c裸鼠，与对照相比肿瘤的体积和重量都明显增加，但同时敲除Hrs，肿瘤生长受到抑制。细胞核动物水平实验结果表明INPP4B以依赖Hrs的方式促进PIK3CA突变的ER+乳腺癌细胞的增殖和生长。

通过促进内吞信号受体和效应蛋白的激活或降解，晚期核内体运输有可能影响许多不同的促增殖途径。Wnt/β-catenin信号通路调控乳腺上皮细胞增殖和迁移，在超过50%的乳腺癌中高度激活。通过转录组学分析，我们检测了GFP-INPP4B和gfp载体表达MCF-7细胞中已知的癌症通路，结果显示几种Wnt/β-catenin通路基因的表达发生了改变，AXIN2 (1.8-fold)，LEF1 (5.6-fold)，DKK1 (3.3-fold)，MYCN (2-fold)，QPCR进行了定量验证，说明在PIK3CA突变的ER+阳性乳腺癌细胞中，INPP4B增强Wnt/β-catenin信号通路应答。INPP4B过表达对GSK3β的mRNA水平无影响，但会降低GSK3β的蛋白水平。降低GSK3β的蛋白水平可以恢复因敲除Hrs引起的晚期核内体形成抑制。PI3K抑制剂BKM120不同剂量浓度对Wnt通路靶基因AXIN2，LEF1，MYCN的mRNA表达水平的影响等研究结果，表明与INPP4B通过增强溶酶体降解GSK3β，促进PI3K依赖的Wnt/β-catenin信号通路。

此项研究发现INPP4B促进晚期核内体和溶酶体的形成以及物质运输，并激活PIK3CA突变ER+乳腺癌患者的Wnt/β-catenin信号通路。INPP4B促进PIK3CA突变ER+乳腺癌细胞增殖与生长，抑制AKT激活。暗示Wnt/β-catenin信号通路对细胞的快速增殖作用优于AKT通路。在三阴乳腺癌中INPP4B经常缺失，PIK3CA突变率低，但PI3K/AKT却异常激活。这暗示INPP4B通过调节PI3K依赖的信号通路，在乳腺癌中扮演致癌和肿瘤抑制的双重角色。