项目文章 | TMT定量蛋白组学助力甘肃农大甜瓜的防御机制研究

欧易/鹿明生物合作客户甘肃农业大学毕阳教授课题组在Food chemistry期刊发表题为 “Sodium silicate prime defense responses in harvested muskmelon by regulating mitochondrial energy metabolism and reactive oxygen species production”的研究成果。本研究通过TMT标记蛋白质组学研究方法表明，Si处理后的甜瓜果实线粒体通过调节被病原菌感染的甜瓜的能量代谢和ROS的产生，启动寄主对Trichothecium roseum侵染的抗性，从而降低了甜瓜的腐烂。

甜瓜（Cucumis melo L.）因其产量和消费量大而成为重要的农作物。但由于真菌病原体的感染导致甜瓜的产量明显降低（约20-40%），瓜果质量也随之受到影响。其中Trichothecium roseum是采摘后引起甜瓜粉腐病的主要真菌。

生理失调、病原菌感染和衰老是导致部分采摘后蔬菜、水果品质恶化的最常见原因。这些疾病与细胞能量有关。然而，水果组织中能量变化的增加和茶多酚的含量变化都会导致水果抗氧化免疫系统的增强。通过提高蔬菜和水果的抗病性，可以减缓衰老病的发生和发展过程。三磷酸腺苷（ATP）由线粒体通过有机酸的呼吸氧化和线粒体电子传输链的电子转移到氧气中产生。在非生物和生物胁迫下，植物线粒体参与了程序性细胞死亡（PCD）的激活和ROS的产生。当真菌攻击植物时，线粒体可能通过激活各种信号，如一氧化氮、活性氧、激发子或水杨酸，发挥防御系统的作用。线粒体接收到的信号通常会影响它们的正常功能。这些信号会破坏细胞器的稳定性，并导致呼吸系统、细胞膜的潜能以及活性氧的产生。然而，少有报道涉及果实防御反应与线粒体之间的关系。

硅（Si）通常被认为是一种安全的物质（GRAS），是激活植物防御的有效激发因子。植物可以通过激活参与反应的多条通路快速而强烈地对胁迫作出反应。在本研究中，使用硅酸钠作为主要刺激物，来促进甜瓜果实进入激活期。另一方面，在初步实验中，蛋白质组的一些研究结果表明，与能量代谢和防御有关的酶也参与了诱导甜瓜果实对病原菌侵染的抗性。采用两步Percoll梯度离心法对甜瓜果实中高纯度线粒体进行富集，进一步探讨其作用机理。检测ROS的变化和来源，分析能量代谢相关酶的活性。采用串联质谱标签（TMT）定量蛋白质组学分析方法，获得了甜瓜果实线粒体蛋白丰度的整体变化，证实了Si处理诱导抗性的启动机制。

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1. 硅处理可减少真菌接种水果的病斑

接种Trichothecium roseum前12h对甜瓜果实进行硅预处理，7d后病原菌引起的损伤面积明显减小。接种后5d和7d，Si处理的甜瓜（Si+C）的病斑面积分别比无Si处理的甜瓜（CK+C）减少55%和42%。表明Si处理诱导了接种病原菌的甜瓜果实对粉腐病的抗性。

2.硅处理提高了线粒体中ROS的产生

经硅处理和菌接种的果实（Si+C），超氧阴离子的产生和过氧化氢的积累迅速增加。用DCHF-DA染色法，在（Si+C）处理果实的24h后，在靠近感染点的1cm区域检测到高荧光。此外，通过染色检测ROS水平表明了生物胁迫对ROS活化的重要性，并与分析整个甜瓜样品时用化学方法检测的结果一致。采用DCHF-DA和Rh123双染法，测定接种点附近薄壁细胞中活性氧的来源。观察表明，Rh123的红色荧光信号与ROS的DCF荧光的绿色信号基本一致，证实线粒体参与了Si处理诱导的ROS产生和病原感染。Si+C样品的荧光强度明显强于对照和病原感染（CK+C）样品，说明Si处理的果实在24h内诱导了明显的组织氧化爆发。

3.能量代谢和ATP含量变化

病原菌感染、衰老和生理紊乱与各类果蔬尤其是采摘后的细胞能量密切相关。本研究中，经硅处理的甜瓜果实的Trichothecium roseum感染增强了甜瓜组织中与能量代谢相关的酶活性，如SDH、CCO和H+-ATPase。

4.甜瓜线粒体TMT蛋白质组学分析

4.1. 甜瓜果实线粒体蛋白质谱的研究

鉴定到5330个肽和1613个蛋白质。

4.2. 差异表达蛋白的功能分类

层次聚类分析表明，同一处理的每3次重复之间差异表达蛋白的趋势表现出较好的一致性。比较两组间的蛋白质丰度，发现19个蛋白表达上调，5个蛋白表达下调（图1）。24种差异表达的线粒体蛋白的GO分析显示出高百分比的基因归因于金属离子结合、氢离子跨膜转运活性、TPase活性和氧化还原酶活性。这些差异表达蛋白参与了甜瓜果实线粒体的一些主要生物学过程，从而阐明和证实了Si处理对甜瓜果实激活状态下线粒体能量代谢的调节机制。

图1 | 差异表达蛋白的层次聚类分析

4.3. 与能量代谢相关的蛋白质

与能量代谢相关的上调蛋白包括细胞色素b-c1复合物亚基7-2、细胞色素c氧化酶亚基5b-2、ATP合酶亚基delta、ATPase F1复合物和α亚基蛋白。在本研究中，发现在硅处理和菌接种的甜瓜果实（Si+C）中，ATP合成酶的2个亚基上调，这与H+-ATPase活性和果实细胞内ATP含量的增加一致。在硅处理的甜瓜激活早期，能量代谢的调节是非常重要的。

4.4. 与防御和应激反应相关的蛋白质

相关研究层表明，生物和非生物胁迫可诱导与防御和应激反应相关的几种蛋白质。在本研究中，小分子热休克蛋白（HSP20）和伴随蛋白CPN60-2（HSP60）在Si处理的甜瓜中在24h内上调。Si处理的甜瓜中HSPs的激活可能是在早期防御过程中诱导非生物Si胁迫的结果。

4.5. 糖酵解和TCA循环相关蛋白

Si在生物胁迫条件下也能显著调节糖酵解途径蛋白。ROS信号和氧化应激是Si处理后线粒体糖酵解和TCA循环调节的主要原因。

4.6. 与氧化还原过程相关的蛋白质

线粒体的氧化还原状态通过能量生产和消耗的微妙平衡保持稳定。在Si处理和菌感染（Si+C）体系中，诱导了两种与氧化还原稳态相关的蛋白，包括乙醛脱氢酶家族2成员B7A和leghemb还原酶。线粒体不仅是果实细胞的能量来源，而且在细胞信号传导中起着关键作用，其信号传导受氧化还原过程的调控。这两种蛋白的上调可能与Si处理后病原-宿主相互作用过程中的氧化应激和细胞信号转导有关。

4.7. 与氨基酸代谢有关的蛋白质

本研究共鉴定到了4种参与氨基酸代谢和γ-氨基丁酸（GABA）运转的蛋白质。天门冬氨酸转氨酶在Si处理和菌接种（Si+C）24h后，丰度增加。但参与组氨酸代谢和氨酰tRNA生物合成的组氨酸tRNA连接酶表达下调。在Si处理和菌接种24h后，GABA转氨酶1和琥珀酸半醛脱氢酶均上调。结果表明，在GABA诱导的植物免疫中，GABA的激活在Si诱导抗性机制和抗性机制之间建立了重要的联系。

4.8. 杂类和非分类蛋白质

DNA回旋酶亚基A在Si处理和菌接种（Si+C）24h后丰度增加。此外，本研究还观察到一种ATP依赖的锌金属蛋白酶FTSH和FTSH 2、含TraB结构域的蛋白质和不确定蛋白Csa_6G186365。然而，这些蛋白在防御启动中的作用还需要进一步研究。

该研究发现Si处理的甜瓜果实线粒体通过调节能量代谢和ROS生成，在抗病启动过程中发挥重要作用。为进一步揭示水果对病原菌感染的诱导抗性机制提供了新的视角和信息。

硅酸钠（Si）处理降低了接种甜瓜的腐烂程度，提高了关键酶的能量代谢活性，使细胞内ATP保持在较高水平，同时Si还诱导了过氧化氢和超氧阴离子等线粒体活性氧（mtROS）的积累。本篇基于TMT的定量蛋白质组学分析显示，共有24种丰度存在显著差异的蛋白质参与能量代谢、防御和应激反应、糖酵解和TCA循环以及氧化还原过程。本研究表明，Si处理后的甜瓜果实线粒体通过调节被病原菌感染的甜瓜的能量代谢和ROS的产生，启动寄主对Trichothecium roseum侵染的抗性。

参考文献

L Lyu, Y Bi, S Li, et al. Sodium silicate prime defense responses in harvested muskmelon by regulating mitochondrial energy metabolism and reactive oxygen species production[J]. Food Chemistry, 2019, 289: 369-376.

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