Cell 精选 | 高精度蛋白质组学方法，揭示黑色素瘤抵抗免疫治疗的可能原因

特拉维夫大学Tamar Geiger（Tamar Geiger课题组一直致力于使用高精度质谱的方法鉴定肿瘤治疗的潜在靶点）教授团队和Sheba医疗中心的Gal Markel团队合作在Cell发表的题为“Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence”的研究成果，通过蛋白质组学技术和功能验证，发现了黑色素瘤细胞的代谢状态通过抗原呈递机制的内在变化和肿瘤微环境的外在变化影响了T细胞杀伤，揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗响应之间的关联，这可能有助于将来改善免疫治疗响应。

免疫疗法彻底改变了转移性黑色素瘤患者的治疗方法，极大地提高了患者的生存率。迄今为止，这种成功很大程度上归因于黑色素瘤的高突变负荷。目前，免疫检查点抑制剂（ICIs）被认为是黑色素瘤免疫治疗的主要手段，尤其是针对CTLA-4或PD1免疫检查点的抗体，但约有50％患者对治疗无反应。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的过继细胞疗法（ACT）是一种不同的免疫治疗策略，在黑色素瘤治疗中显示出很高的疗效。当前人们已投入大量精力来确定预测性反应指标和揭示耐药机制，但主要是使用组织学、基因组学和转录组学方法，尚还缺少对黑色素瘤进行深入的蛋白质组学分析。

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1.黑色素瘤对TIL和抗PD1响应的蛋白质组学分析

为了鉴定与免疫治疗响应相关的蛋白质网络，作者收集了116个IV期黑色素瘤样本，包括42例接受TIL治疗的患者和74例接受抗PD1治疗的患者，并进行了蛋白质组分析。

作者将每个队列分为响应组（包括部分响应者和完全响应者；n = 61）和无响应组（进行性疾病；n = 48）。PD1队列包括其他疾病稳定的患者（n = 7）（图1A）。对患者临床参数的检查表明，响应者和无响应者在总体生存率上存在显著差异（图1B）。年龄和BRAF突变状态在两组之间均无显著差异。此外，先前的靶向治疗（n = 16）或抗CTLA-4（n = 29）治疗均未显示出与响应相关。

在TIL队列中发现性别之间存在显著相关性，并且在响应者中血浆LDH水平低于两个队列中的非响应者（p值<0.005；卡方检验）。对于蛋白质组学分析，作者解剖了>80％肿瘤细胞的黑色素瘤区域。为了获得准确的蛋白质组定量，作者设计了一种super-SILAC混合物，该混合物由5种SILAC标记的黑色素瘤细胞系组成，可作为标准化的参考。然后将混合物以1：1的蛋白质比例掺入每个黑色素瘤样品中，以用作定量参考。混合的蛋白裂解液经酶切和分馏后，用Q-Exactive Plus或HF质谱仪进行检测（图1C）。结果共定量到10,376种蛋白质，响应者和非响应者之间的覆盖范围没有明显差异（图1D-1E）。进一步过滤保留至少70％的样品中鉴定出的蛋白质，这些蛋白中包括800多种与信号转导相关的蛋白以及数十种受体和转录因子相关的蛋白，表明它们足以覆盖细胞内过程的分析。

图1 | 黑色素瘤对免疫治疗响应的蛋白质组学

2.免疫疗法响应者和无响应者的功能分析

作者通过Student t检验在TIL治疗和抗PD1治疗人群中分别鉴定了414和636个响应者和无响应者间的差异表达蛋白。通路Proteomaps基于KEGG注释对两组差异蛋白进行聚类，发现两种治疗方法的图谱有惊人的相似之处（图2A）。在这两种治疗方法下，响应组均以较高水平的代谢蛋白为主，而非响应组则为剪接体和RNA代谢相关蛋白为主。除代谢类别外，两种治疗方法的响应组均具有更高比例的抗原呈递以及信号传导相关蛋白。与两种疗法之间的通路高度相似性相一致，二维注释富集分析结果表明两种疗法富集类别有着高相关性（R = 0.76）。在这两种治疗中，响应组的线粒体代谢通路都显著富集（图2B）。鉴于两种疗法的响应组谱图在功能上相似，作者使用所有116例样本的数据集，进行了WGCNA分析。结果中得到了一组与患者无进展生存期，完全或部分响应以及血浆LDH水平呈正相关的模块。与之前的结果一致，这些模块富集到了抗原呈递，IFNG信号以及线粒体代谢通路（图2C）。总而言之，这些分析强调了线粒体代谢的差异通常与免疫治疗反应相关。

图2 | 免疫疗法响应者和无响应者间的功能差异

3.鉴定免疫治疗响应的蛋白质标志物

为了鉴定与响应有关的特征蛋白，作者使用基于SVM的分类方法（基于ANOVA的特征排序），在TIL治疗队列筛选出8个特征蛋白，其中6个在响应组中上调，2个下调（图3A）。在抗PD1治疗队列中筛选出15种特征蛋白，所有特征蛋白均在响应组上调（图3B）。两组特征蛋白没有重叠，TIL治疗队列包括与脂肪酸和酮体代谢有关的蛋白质，抗PD1治疗特征蛋白由多种抗原呈递相关蛋白组成。统计分析表明抗PD1队列的15种特征蛋白质中，有12种具有统计学意义（图3C）。总体而言，作者在抗PD1治疗队列中发现了95种显著变化的蛋白质，其中83种在响应组中上调。由于TIL队列较小，因此没有显著变化的蛋白质。为了提高分析的统计能力，作者合并了两个队列，发现响应者和非响应者之间有160种显著变化的蛋白质（图3D）。

图3 | 响应于免疫治疗的特征蛋白

构建响应蛋白的相互作用网络得到两个高度连接的蛋白簇。第一个蛋白簇富集了IFN，抗原加工和呈递机制蛋白。第二个蛋白簇富集了参与脂质代谢和TCA循环的线粒体代谢酶（图4A–4C）。因此，尽管蛋白不一定在两种治疗情况下都能预测反应，但线粒体-IFN网络与两种治疗都相关。TIL队列中六个上调的特征蛋白在抗PD1队列中也上调（图4D）。类似地，抗PD1队列的15种特征蛋白中的10种在TIL队列中也显示出相似的趋势。重要的是，TIL响应组中MHC相关蛋白和抗原呈递机制蛋白均高于无响应组（图4E）。接下来，作者分析了特征蛋白与无进展生存期（PFS）的关系。Kaplan Meier分析显示在TIL队列中，ACAT1，SUPV3L1和HTATIP2的高表达与更长的PFS正相关（图4F）。在抗PD1队列中，大多数特征蛋白与更长的PFS显著相关。对每个特征蛋白在另一个队列中的分析表明，它们几乎与存活率无关（图4F）。

图4 | 免疫治疗响应的综合分析

蛋白质组学结果将黑色素瘤的代谢状态与抗原呈递和IFN信号传导相关联。鉴于这些分析可能已平均了来自不同细胞群体的信号，作者通过连续切片的免疫组化检查了关键特征蛋白在组织水平上的空间表达。免疫组化结果与蛋白质组学数据一致，这些蛋白在响应组和非响应组间的表达有着显著差异，并且这些蛋白是在黑色素瘤细胞中特异性染色（图5A和5B）。线粒体标志物和电子传输链（ETC）组分SDHA的染色在响应组的线粒体中显著增加（图5C）。作者接着检查了代谢蛋白表达与T细胞浸润之间的关联（图5C和5D）。与这些患者中更高的疗效相一致，作者发现CD8或CD3 T细胞染色与特征蛋白ACOT1，ACAT1和HADHA之间具有高度相关性（图5C）。总而言之，这些结果证明肿瘤线粒体代谢与细胞免疫原性之间存在明确的联系，这值得进行下游功能研究。

图5 | 代谢蛋白和T细胞浸润的组织水平验证

4. 黑色素瘤细胞免疫原性代谢调控的功能验证

除了代谢特征和免疫响应之间的相关性之外，作者考虑线粒体代谢是否在增加肿瘤免疫原性方面具有功能性作用。为了诱导增加培养细胞的线粒体呼吸，作者用丙酮酸脱氢酶激酶的抑制剂二氯乙酸（DCA）处理了四种黑色素瘤细胞系，这增加了进入线粒体的碳通量。经DCA处理的细胞蛋白质组学分析显示，涉及抗原呈递的多种蛋白质表达增加（图6A）。在MHC I类蛋白中，大多数DCA处理后的黑色素瘤细胞系中HLA-A表达略有降低，而HLA-B和HLA-C显著升高，并且主要的抗原呈递因子TAP1，TAP2和B2M在不同的细胞系中显示出不同的行为。根据蛋白质组学结果，作者发现DCA处理可增加细胞表面HLA的表达，并增加mRNA表达水平（图6B-6D）。这些结果表明代谢状态不仅与治疗的响应相关，而且在增加总体抗原呈递方面具有调节作用。

为了直接在特征蛋白和抗原呈递之间建立联系，作者使用了CRISPR-Cas9系统在WM266-4和Mel526黑色素瘤细胞系中敲除了两个TIL特征基因ACAT1和HADHA。此外，在同种细胞中敲除了脂肪酸氧化的主要调节剂CPT1A。蛋白质组学分析显示，与敲除细胞相比，对照组中的抗原呈递和IFN信号以及氧化磷酸化和电子传递链过程显著富集（图6E）。对基因扰动的下游影响的研究表明，在Mel526细胞中敲除ACAT1，HADHA或CPT1A后，MHC I类强度降低，HLA II类呈递细胞百分比降低（图6F，6G）。蛋白质组学分析进一步验证了这些结果，并显示了其他关键抗原呈递机制蛋白在两组间具有更高的比值（图6H）。这些结果表明，即使是TIL特征蛋白中的单个线粒体蛋白也可以影响抗原呈递机制和MHC I类表达。

图6 | 抗原呈递的代谢控制

代谢对抗原呈递的作用说明这些可能影响T细胞识别和肿瘤细胞杀伤。为了检验这一假设，作者将敲除组或对照组黑色素瘤细胞与匹配的T细胞共培养，并通过LDH分泌监测细胞死亡。与抗原呈递机制蛋白下调相一致，在ACAT1，HADHA和CPT1A敲除后，特异性T细胞的杀伤力明显降低（图7A）。为了通过体内小鼠模型检查这些效应，作者敲除了小鼠黑色素瘤细胞系YUMMER1.7中的Acat1，并监测其对免疫活性小鼠的肿瘤生长和免疫浸润的影响。结果表明敲除Acat1后肿瘤生长显著增加（图7B）。

基于体外观察结果，作者假设敲除Acat1减少了T细胞识别，从而促进了肿瘤的进展。实际上，敲除Acat1的肿瘤细胞在RNA和蛋白质水平上均显示MHC I类和PD1配体（Pdl1）表达的显著降低（图7C–7F）。此外，与IFNG一起孵育24小时后，敲除细胞显示出对MHC I类，Pdl1和B2m的诱导作用降低（图7G）。免疫细胞谱分析显示，与对照相比，敲除Acat1的肿瘤中细胞因子产生的T细胞（cytokine-producing T cells）水平较低（图7H和7I），而浸润CD4 +和CD8 + T细胞的总百分比没有变化（图7I-7L）。此外，敲除Acat1的肿瘤中单核细胞髓样细胞（monocytic myeloid cells）的比例显著低于对照（图7M），而巨噬细胞的比例显著上升（图7N）。总的来说，这些结果说明了这些蛋白质作为影响黑色素瘤和免疫细胞调节剂的重要性。

图7 |  CRISPR敲除对肿瘤免疫原性和T细胞活性的影响

免疫疗法彻底改变了癌症的治疗方法，但是大多数患者没有响应。本文通过蛋白质组学研究来自肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗或抗PD1免疫治疗的晚期黑色素瘤患者的临床样品。统计分析表明在两种治疗中，响应组的氧化磷酸化和脂质代谢均高于非响应组。为了阐明代谢状态对免疫响应的影响，作者在代谢扰动或CRISPR-Cas9敲除后检查了黑色素瘤细胞。这些实验结果表明脂质代谢是通过提高抗原呈递而增加黑素瘤免疫原性，从而增加了对T细胞杀伤的敏感性。总的来说，蛋白质组学分析揭示了黑色素瘤代谢状态与免疫治疗响应之间的关联，这可能有助于将来改善治疗响应。

本文作者通过对两种免疫疗法患者组织样本的蛋白质组学分析，提出黑色素瘤细胞的代谢状态通过抗原呈递机制的内在变化和肿瘤微环境的外在变化来影响T细胞杀伤。这些结果为复杂的免疫代谢网络增加了新的认知，这可能具有重要的治疗意义。蛋白质组学在肿瘤研究领域进展迅猛，已有多种肿瘤的研究成果发表于顶级学术期刊。本文也又一次证明了蛋白质组学在生命科研领域研究中的重要作用。

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云起  撰文

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