可重现的CCS值如何实现代谢物的高置信度注释

2020-12-10 05:13:55, 4D-组学老虎队布鲁克（北京）科技有限公司-质谱仪器

为了获得代谢组学中 LC-MS/MS 数据的准确注释，需要结合多个维度的信息，如二级谱图，保留时间，碰撞截面积值（CCS 值）等。其中，CCS 值代表的是化合物的空间结构大小，具有一定的特异性。

本文考察了实验室内部和不同实验室之间 timsTOF Pro 测量的 CCS 值的可重复性，同时将测得的 CCS 值和文献中的值进行比较。实验结果表明 CCS 值有着良好的重现性，可作为代谢物注释过程中的一维定性信息。

样品制备

NovaMT 样品：

Hydrophilized urine（www.novaMT.com, TRX-3178-R），200ul LC-MS 级纯水稀释。加入 250ul 甲醇，涡旋并离心 5min。取上清液加入 600ul 流动相 A。

数据采集

数据处理

数据处理使用 MetaboScape 2021（预发行版本）。使用 Analytelist 对化合物进行注释，注释使用的信息包括：一级准确质量数、保留时间、同位素峰信息、MS/MS 匹配度和 CCS 值。

统计学分析（PCA 和 t-test），Pathway mapping 同样在 MetaboScape 中完成。咖啡因和可可碱的代谢通路来源于https://www.wikipathways.org/index.php/Pathway:WP3633。

结果与讨论

代谢物注释过程如图1 所示。图1 给出了黄嘌呤（paraxanthine）的注释结果，质量偏差为 0.242mDa，CCS 值偏差为 0.8%。mSigma 值代表同位素峰匹配度，当 mSigma 值小于 20 时，表示与理论同位素分布有很高的重合度。图1C 为可视化的鉴定结果打分，绿色代表所有参数都匹配的非常良好。图1E 给出了实测 MS/MS 谱图和数据库 MS/MS 谱图的对比。

图1：黄嘌呤（paraxanthine）的注释过程

使用分别位于澳大利亚珀斯和德国不来梅的两台 timsTOF Pro 对样品进行分析。每个样本进行四次技术重复。共得到 CCS 值 120-210Å² 的 20 种高置信度的代谢物的注释结果。实验室内部的结果显示 CCS 值的平均偏差很小，具体偏差结果见表1。不同实验室之间的 CCS 值对比也呈现很小的偏差。不来梅 vs 珀斯的 |ΔCCS| 正离子仅为 0.25%，负离子为 0.15%。图2 给出了两台仪器 20 种代谢物 CCS 值的对比。

图2：两台 tims TOF Pro 测得的 CCS 值结果对比

将实验值和文献值进行对比，平均的 |ΔCCS[%]| 结果见表2。对于所有的代谢物偏差均小于 2%。CCS 值和保留时间一样，都可以作为扩展的代谢物注释的信息。但保留时间受液相仪器的影响较大，不同的仪器之前保留时间存在着较大的偏差。而上述的实验表明 CCS 值在多台 timsTOF Pro 以及 timsTOF Pro 和文献值之间具有很高的重现性，这大大提升了使用 CCS 值对代谢物注释的置信度。