Incucyte® 应用小站 | 活细胞ATP代谢的实时动态分析

2020-11-19 04:36:06, 赛多利斯德国赛多利斯集团

ATP是新陈代谢所需能量的直接来源。癌细胞为获得它们不断增殖所需的能量而改变代谢信号通路，这些代谢信号通路是潜在的药物靶点。基于ATP代谢异常的疗法开发，也成为目前癌症和其他适应症研究的一个活跃领域。

图1. 正常细胞和癌细胞的能量代谢比较

因此，研究人员需要相关模型来研究ATP代谢变化。目前的技术限制了复杂的癌细胞模型在增殖及与环境相互作用时的能量代谢变化的评估。检测代谢变化的传统技术：

1	采用终点分析，而不是进行动力学评估。
2	使用间接的代谢副产物检测，而不是直接检测代谢ATP输出。
3	在复杂的共培养模型中，无法区分特异细胞类型的代谢变化。
4	没有纳入与生理相关的环境条件，从而引入潜在的人为因素。

Incucyte®

ATP分析提供一种端到端的解决方案，由仪器、软件和试剂组成，能够直接可视化分析ATP实时动态变化；同时，可以将ATP代谢与细胞形态变化联系起来，以揭示细胞行为的信息和时间变化——前所未有地评估新陈代谢变化！

图2. Incucyte® ATP可视化动态分析方案

Incucyte® ATP代谢分析的主要优势

新型、无干扰的试剂，实现活细胞内ATP动态分析

	Incucyte CytoATP 慢病毒试剂可在多种类型细胞中表达基因编码的荧光ATP指示器，用于直接检测活细胞内的ATP动态变化。
	基于FRET的指示器，通过双激发单发射捕获，可以精确测量相对ATP。
	使用CytoATP非结合对照，允许分析校正后的ATP比率指标。

图3. Incucyte CytoATP 慢病毒试剂用于细胞ATP动态分析。与亲代细胞相比，CytoATP表达细胞的形态（A）和细胞增殖（B）没有变化。（C）稳定表达CytoATP指示器的Hela细胞，用2DG + KCN处理分别抑制糖酵解和氧化磷酸化，显示ATP快速、浓度依赖性下降。

分析复杂共培养模型中细胞类型特异性的ATP变化

在生理相关的环境，对共培养模型中特定类型细胞群体的ATP变化进行可视化检测和自动分析，以便更深入地了解动态肿瘤环境，最大化您的代谢洞察力。

图4. Incucyte ATP分析单培养和共培养模型中细胞特异性的ATP动态变化。(A)稳定表达CytoATP的TNBC细胞系HCC1806单培养或与CCD14086SK成纤维细胞共培养。使用Incucyte® ATP分析软件模块来识别细胞内ATP变化(Mask图像)。(B)和(C)单培养模型：动力学数据显示，与单培养的MCF-7细胞相比，CB-839处理抑制谷氨酰胺酶-1后，HCC1806细胞的ATP消耗持续时间更长。共培养模型：在HCC1806细胞中，基质细胞共培养介导了对CB-839的抗性，而MCF-7细胞在单培养和共培养中没有表现出差异效应。

评估ATP对化合物响应的时间依赖性变化

不同处理条件的ATP变化可能非常快，Incucyte可自动进行短时间实时动态监测，也可实现长达72h及更长时间的ATP动态响应分析，生成实时ATP代谢数据及浓度反应曲线。

用半乳糖替代葡萄糖的培养基条件，促使细胞依赖氧化磷酸化进行能量代谢，可检测氧化磷酸化ATP生产/利用的变化。

图5. 用无损的重复ATP测量鉴别有丝分裂毒和细胞毒化合物。稳定表达CytoATP的NIH 3T3细胞或ATP非结合对照细胞，在标准条件(葡萄糖)生长，或在含有半乳糖取代葡萄糖的生长培养基中生长以促使细胞依赖氧化磷酸化进行能量代谢。细胞分别用无毒（Ambrisentan）、细胞毒（Chlorpromazine）或有丝分裂毒（Nefazodone）化合物处理，获得10×荧光图像。动力学数据显示用细胞毒性或有丝分裂毒性化合物处理的细胞中ATP的快速消耗。虽然在两种培养基条件下对细胞毒性化合物的反应相似，但Nefazodone在半乳糖生长的细胞中IC50的左移表明其线粒体毒性。在早期观察到更大程度的分离，这表明CytoATP动力学数据可以为评价化合物谱提供额外的见解。

同时评估细胞形态变化

可以将ATP代谢与细胞形态变化联系起来，以揭示细胞行为的信息和时间变化。

图6. 利用高清晰相差图像对细胞形态进行定性检测。稳定表达CytoATP的HeLa细胞或ATP非结合对照细胞，用Chlorpromazine (60 µM)、Etoposide (100 µM) 或 2DG (20 mM) + KCN (2 mM)处理，动力学分析显示这些化合物消耗ATP的时间效应变化(见各右下角插图)。同时获得的细胞高清相差图像(10×)显示，Chlorpromazine处理(21小时)和Etoposide处理(75小时)的细胞形态发生了剧烈变化，而2DG + KCN处理(60分钟)的细胞与对照相比，没有出现显著的形态变化。

Incucyte®活细胞成像分析系统和代谢光学模块及相关试剂，还可实现对细胞增殖、细胞死亡和线粒体膜电位的测量，从而可以提供更多的洞察和支持数据。