Cell Review：接地气总结高端同位素示踪技术

2018-12-27 11:59:26, Metabo-Profile 麦特绘谱生物科技(上海)有限公司

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质谱等分析技术的飞快发展加速了代谢组学在诸多疾病中的应用，然而，测定代谢物浓度变化仅仅是代谢组学研究工作的一部分。我们还需探究在激活的代谢通路里面这些代谢物在单位时间内流量（代谢流）发生了怎样的变化。事实上代谢物浓度和流量并不总是匹配，就像交通堵塞时车辆多反而流量低（Fig.1A），例如若去除酵母培养基的葡萄糖，糖酵解流量会急剧下降，但其下游的代谢产物浓度反而升高。采用同位素示踪技术，可以对目标Pathway的代谢通量的流向和大小进行测定，从而精确判断哪条代谢通路发生了何种变化，通过测定同位素标记的代谢底物代谢到不同通路的比率和速率来判断关键代谢酶的活性变化。代谢组学与同位素示踪技术的结合，无疑可为疾病机制研究回答更多的疑难问题，提高代谢组学的研究深度。普林斯顿大学化学系Lewis-Sigler研究所Joshua D.Rabinowitz教授近期在《Cell》上发表综述，总结归纳了同位素示踪研究流程中有关样本制备、数据检测分析、数据整合分析等工作细节，并强调了代谢组学及同位素示踪技术在生物医学研究中的重要性。

现将文章中与同位素示踪相关内容总结如下：

样本制备

理想的实验结果始于精心的实验设计。对于同位素示踪实验，首先，稳定同位素的选择很重要，根据不同研究目的需选择不同的稳定同位素示踪剂，以下图表中列出的同位素示踪剂可供大家根据各自需求进行选择。此外，实验中要控制好各种影响因素，比如体内实验要注意饲养、空腹、饮食结构等方面；细胞培养则要注意培养基的选择及培养基的更换时间等；以及同位素示踪剂的浓度、时间等等。进行同位素示踪实验时，一定要避免代谢物之间的交叉干扰，如特殊营养培养基的更换，其余营养物质的浓度要注意是否保持一致。标记感兴趣的通路代谢物时，需要注意研究最终目的是获取动态的物质浓度还是稳态时的物质浓度。一般而言，细胞培养时，糖降解过程达到稳态需要10min，三羧酸循环（TCA）需要超过2h，到达核苷酸则需要24h以上，但不同种类的细胞代谢时间不同。有时也需要连续收集样本去获取糖降解的动态结果（如10s为一个时间循环），而TCA可设定在15min，30min，60min，120min分别收集样本。其次，是关于代谢物的收集方法。不同的生物样本其要求不同，尤其是很多瞬间即逝的重要代谢物，及时的终止代谢过程、获得准确代谢物信息是实验的关键。常规方法包括冷冻或者酶变性法。细胞实验经常采用加入低温有机溶剂降低代谢活性并促使酶的活性永久变性，而组织样本可以先-80℃冻存再进行低温有机溶剂提取。如果低温有机溶剂不能立即终止酶活性应该怎么解决？如NADPH，ATP等这些高能量物质即使缓和降解仍然会引起NADP、ADP、AMP明显增加。对于这类物质，可以采用添加酸的有机溶剂加速酶变性，比如加入0.1 M甲酸的混合溶剂（乙腈：甲醇：水=40：40：20）。最后，要保证样本收集的一致性。

样本检测

样本收集后，接下来的挑战便是尽可能保证检测结果的准确性。分析技术主要是NMR及MS技术，NMR不仅可以确定化合物上被标记的碳的数量（isotopomer），同时也可确定稳定同位素所标记上的位置（isotopologue），从而追踪某一代谢物的不同通路来源，但对于混合物分析，NMR解谱相对难度大。如今，越来越多的研究者选择用MS来检测，因为其具有更出色的灵敏度、分辨率及特异性等性能。尤其是气相色谱质谱联用技术（GC-MS），可以利用硬电离（EI）和软电离（CI）得到不同的代谢物的碎片信息，从而判断同位素标记的不同位置。

同时，色谱分离对于同位素示踪研究尤为重要。色谱分离技术不仅可以将质荷比接近的物质分开，防止其他物质对同位素丰度的影响，同时也可以分离来自不同代谢通路的同分异构体，从而得到准确的代谢通路信息。常见代谢组学平台分为气相色谱质谱联用（GC-MS）和液相色谱质谱联用（LC-MS）。GC-MS利用其30米，甚至60米的长色谱柱，通常能较好的分离不同的代谢物。LC-MS通过采用不同的色谱柱可以检测不同种类代谢物，如反相色谱柱C18适用于检测极性代谢物和脂质，HILIC色谱柱可检测各类强极性物质。

数据分析

由于各种代谢物同位素的混合及天然同位素的存在，样本中同位素丰度会有所升高。因此，在分析同位素数据之前，校正天然同位素丰度的影响是非常重要的环节。比如天然¹³C丰度可达1.1%，¹⁸O丰度为0.2%。考虑到可用同位素及质谱的检测能力，最好采用所有相关天然同位素进行校正。目前相关软件可以进行相关校正计算。部分标记可以为完全标记提供相应的补充信息。同位素标记实验数据可视化可以采用多分类累积柱状图（stacked bar），不同的颜色代表不同同位素标记形式。

代谢组学与同位素示踪技术应用

稳定同位素示踪技术对生命科学的重大贡献之一是阐明生物体内的物质处于不断的动态平衡之中，通过向生物体内引入适当的同位素标记物，在不同时间测定物质中同位素含量的变化，就能够了解到该物质在体内的变动情况，通过定量计算体内物质的代谢率，获取物质的更新速度和更新时间等信息。因此，采用同位素示踪技术可针对特定的通路探索代谢物来源和流向并揭示其活性从而促进对疾病机制的认识。现已越来越多的被应用于各类疾病研究中，它们基本可以实现以下层次水平的研究。

非靶向代谢流分析：通过寻找到代谢网络中发生代谢变化pathway的关键代谢物的¹³C Flux ratio变化，揭示其相应途径的酶活性变化情况。

代谢途径追踪分析：代谢组学的研究结果无法回答代谢物的升高是因为更快的生成还是更慢的消耗，而这往往是问题的关键。稳定同位素标记的代谢流分析将更好的阐述代谢物浓度的变化在特定代谢通路中是如何实现的。通过分析下游标记代谢物的动态变化可以揭示代谢通路中各支路的流量变化。另一个选择是在同位素标记稳态时进行分析，这样可以避免对不同时间点进行检测分析。此时，部分标记的示踪剂比全标的更有效。例如，[1,2 -¹³C]葡萄糖经过磷酸戊糖途径（PPP）会生成M+1乳酸，而经过糖酵解途径会生成M+2乳酸，两者的比例反应了葡萄糖流向PPP和糖酵解通路的比例。

体内同位素示踪：体内同位素示踪研究要比细胞或者微生物实验更复杂，其不仅是分析标记代谢物的变化，还要考虑同位素标记代谢物的药代动力学信息，即外周血中示踪剂和代谢物的水平。对于这种复杂的情况，可以先进行简单的计算，如同位素转入速率。另一种有价值的分析是检测外周血中营养物质进入到组织中的比例。比如谷氨酰胺对TCA循环贡献了多少？通过注射标记的谷氨酰胺，检测达到稳态时外周血中标记的谷氨酰胺和组织中标记TCA中间产物的比例，可以估算谷氨酰胺进入TCA的循环量。研究人员通过这种方法发现尽管在体外培养癌细胞时谷氨酰胺是TCA循环主要的贡献者，但在机体内却只贡献很少一部分。当注入的营养物质通过代谢转换为其他物质，间接的为组织提供能量，如果要测量不同物质的贡献量，则需要对循环中所有物质（如glucose, lactate,glutamine）进行标记。例如，通过这种方法，研究人员发现标记的葡萄糖主要是通过外周循环的乳酸进入TCA：某些细胞将葡萄糖分解为乳酸，然后进入血液循环中，再作为主要的TCA底物为大部分组织甚至肿瘤提供能量。