客户案例 | Cancer Commun：谷氨酰胺酶GLS从“剪接偏向”到“代谢脱轨”：肝癌背后的铁死亡逃逸事故

肝细胞癌（HCC）是恶性程度极高、预后很差的常见肝癌类型，超过60%患者存在EGFR（表皮生长因子受体）高表达，这也是肿瘤快速生长、容易转移和治疗耐药的重要原因。癌细胞会通过代谢重编程获取能量，其中谷氨酰胺分解代谢异常活跃，而谷氨酰胺酶GLS是这一过程的关键限速酶。GLS会通过可变剪接形成GAC和KGA两种亚型，高活性的GAC更能促进肿瘤发展，但调控这一剪接过程的机制并不清楚。同时，m⁶A作为重要的RNA表观修饰，多关注mRNA稳定性，较少关注pre-mRNA剪接。此外，肝癌对铁死亡这种程序性死亡具有很强的抵抗性，进一步降低了治疗效果。因此，揭示EGFR信号如何通过m⁶A修饰调控GLS剪接、进而影响铁死亡抵抗，对寻找肝癌新靶点具有重要意义。

图1. 技术路线

1. EGF促进GAC亚型表达并增强谷氨酰胺分解

为探究EGFR激活对HCC代谢的影响，研究者首先对EGF处理后的HCCLM3细胞进行了非靶向代谢组学分析（麦特绘谱提供），结果显示，谷氨酰胺分解相关代谢物显著上调，通路富集分析进一步确认谷氨酰胺与谷氨酸代谢通路被显著激活。稳定同位素[U-¹³C₅]-glutamine示踪代谢流实验分析（麦特绘谱提供）证实，EGF处理增强了谷氨酰胺向谷氨酸、α-酮戊二酸及三羧酸循环中间产物的转化。在 GLS两种剪接亚型中，EGF特异性上调高活性亚型GAC的蛋白与mRNA水平，对KGA无明显影响，使GAC/KGA比值显著升高；RNA‑seq与双荧光素酶报告实验证实，EGF通过促进GLS前体mRNA选择性剪接，使转录本更倾向生成GAC。临床数据库分析显示，GAC高表达与HCC患者更差的总生存期显著相关，而KGA表达与预后无关联，提示GAC是介导EGF促癌效应的关键功能亚型。

图2. EGF在促进谷氨酰胺分解的同时调节GLS亚型的表达

2. m⁶A修饰调控GLS剪接偏向GAC亚型

EGF处理可显著提高HCC细胞中总体m⁶A修饰水平，使用甲基化抑制剂DAA或环亮氨酸处理后，GAC表达下降而KGA上升，直接证明m⁶A参与GLS剪接调控。通过SRAMP和RMBase预测GLS pre-mRNA剪接调控区域存在5个潜在的m⁶A修饰位点，进一步MeRIP-qPCR确认EGF增强了这些位点的m⁶A富集。位点定向突变和荧光剪接报告实验表明，P1位点是调控GAC剪接偏向的关键位点，P1 位点突变可完全逆转EGF介导的GLS剪接偏向，使GAC生成减少。RNA pulldown结合质谱鉴定出m⁶A“reader”蛋白YTHDC1特异性结合P1位点，RIP-qPCR证实EGF增强YTHDC1及剪接因子SRSF3与GLS RNA的结合。体外和体内RNA pulldown实验进一步验证了这一互作。CRISPR介导的GLS P1位点突变或YTHDC1敲低均可消除EGF诱导的GAC/KGA比值升高，说明m⁶A修饰通过YTHDC1-SRSF3轴调控GLS剪接。

图3.m⁶A修饰调控GLS剪接偏向GAC亚型

3. AKT磷酸化WTAP S176促进其与METTL3结合

机制探索显示，EGF通过激活下游AKT信号增强WTAP与METTL3的结合，抑制AKT可完全阻断这一效应，而抑制其他激酶无明显作用。体外激酶实验证实，活化AKT可直接磷酸化WTAP的176位丝氨酸（S176）；将S176突变为丙氨酸（S176A）后，EGF无法诱导WTAP磷酸化及WTAP‑METTL3结合增强；模拟磷酸化突变体S176D则在无EGF刺激时即可增强二者结合。功能实验表明，WTAP S176磷酸化是EGF提升整体m⁶A水平的必要条件，回补S176A突变可完全逆转EGF诱导的m⁶A高修饰，证实AKT‑WTAP磷酸化轴是连接EGFR信号与m⁶A修饰的关键分子开关。

图4. WTAP S176磷酸化促进WTAP-METTL3结合

4. WTAP磷酸化通过m⁶A依赖方式调控GLS剪接与代谢功能

在确认WTAP磷酸化调控m⁶A修饰后，进一步验证其对GLS剪接的影响。RIP-qPCR显示，WTAP S176A突变逆转了EGF诱导的WTAP与GLS RNA结合增强，MeRIP-qPCR也证实该突变阻断GLS P1位点的m⁶A富集。报告基因和RG6剪接实验一致表明，WTAP S176A抑制EGF诱导的GAC剪接偏向。相反，WTAP S176D模拟磷酸化可增强GAC表达，该效应可被GLS P1位点突变完全消除。功能代谢方面，WTAP S176A表达阻断EGF诱导的GLS酶活性升高、GSH/GSSG比值升高及NADP⁺/NADPH比值降低，而WTAP S176D则模拟这些效应。以上结果表明，WTAP S176磷酸化通过m⁶A依赖性方式调控GLS剪接，进而增强谷氨酰胺分解和抗氧化能力。

图5. WTAP的磷酸化以m⁶A依赖的方式诱导GLS剪接偏向

5. GLS剪接偏向介导HCC细胞对铁死亡的抵抗

鉴于GSH和NADPH在抑制铁死亡中的关键作用，探讨了上述轴是否赋予HCC铁死亡抵抗。在胱氨酸剥夺或Erastin处理下，EGF显著抑制脂质ROS积累和细胞死亡，并提高细胞活力。然而，在表达WTAP S176A或GLS P1位点突变的细胞中，EGF的这些保护作用被完全消除。铁死亡抑制剂Fer-1可部分逆转上述效应。相反，表达WTAP S176D模拟磷酸化突变可抑制Erastin诱导的铁死亡，而该保护作用同样被GLS突变所阻断。此外，在PTEN缺失的胶质母细胞瘤细胞中，也观察到AKT-WTAP-GLS轴的激活与铁死亡抵抗相关。这些结果一致表明，EGFR-AKT-WTAP-GLS轴通过诱导GAC剪接偏向，增强抗氧化能力，从而使HCC细胞抵抗铁死亡。

图6. GLS剪接改变驱动肝癌细胞对铁死亡的抵抗

6. WTAP介导的GLS剪接偏向促进体内肿瘤生长

为验证上述机制在体内的病理意义，将表达EGFRvIII的HCCLM3细胞分别构建WTAP S176A或GLS突变体，并接种于裸鼠皮下。结果显示，WTAP S176A或GLS突变均显著抑制肿瘤生长，并延长小鼠生存期。联合使用铁死亡诱导剂SAS进一步增强了肿瘤抑制效果，同时降低GAC表达并升高脂质过氧化标志物4-HNE水平。此外，研究者设计了靶向GLS P1位点的剪接切换ASO5，该ASO能有效降低GAC/KGA比值，增强Erastin诱导的铁死亡。在体内，ASO5联合SAS同样表现出显著的协同抗肿瘤作用。最后，联合使用EGFR抑制剂西妥昔单抗与铁死亡诱导剂IKE也显著抑制肿瘤生长并延长生存。这些结果证实靶向GLS剪接偏向或联合铁死亡诱导剂具有治疗潜力。

图7. WTAP介导的GLS选择性剪接促进肿瘤细胞生长

7. WTAP pS176和GAC表达与HCC患者不良预后相关

为评估该机制的临床相关性，研究者对30例HCC组织及配对正常组织进行了免疫组化染色。结果显示，肿瘤组织中WTAP pS176和GAC表达显著升高，而脂质过氧化标志物4-HNE水平降低。相关性分析表明，WTAP pS176与GAC表达正相关，两者均与4-HNE负相关。在90例HCC患者的生存分析中，WTAP pS176或GAC高表达组的总体生存期显著短于低表达组。上述临床数据进一步支持，EGFR-AKT-WTAP-GLS轴在HCC中活跃，并与铁死亡抵抗及患者不良预后密切相关。

图8. WTAP pS176和GAC预测肝细胞癌的临床侵袭性

本研究阐明，EGFR-AKT信号通过磷酸化WTAP S176，增强其与METTL3结合，促进GLS pre-mRNA的m⁶A修饰，进而招募YTHDC1/SRSF3诱导GLS剪接偏向高活性GAC亚型。该剪接开关增强谷氨酰胺分解及GSH/NADPH合成，有效抑制铁死亡并促进HCC生长。WTAP pS176和GAC高表达与患者不良预后显著相关。靶向该轴的剪接切换ASO5或联合EGFR抑制剂与铁死亡诱导剂在体内协同抑瘤。揭示了m⁶A依赖性剪接重编程在铁死亡抵抗中的新机制，为HCC提供了潜在治疗策略。

参考文献

WTAP-Mediated Glutaminase Splicing Bias Suppresses Ferroptosis in Hepatocellular Carcinoma. Cancer Communications. 2026

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