2020 版《中国药典》系列探讨 | 谁说标准方法就只能一成不变？

2020-01-11 09:24:57, 安捷伦 SDT 团队安捷伦科技（中国）有限公司

2018-2019 年，国家药典委员会相继公布了 2020 年版《中国药典》四部通则 0512 高效液相色谱法的三次征求意见稿。与 2015 年版药典相比，该意见稿主要修订并增加了色谱参数允许调整的范围、定性分析的方法以及对多维色谱的阐述。

对于制药从业者而言，2020 年版《中国药典》中的最大变（福）更（音）要数修订了色谱参数允许调整的范围，即超高效液相色谱（UHPLC）方法的引入。

药典的 UHPLC 时代正式来临！

在此之前，收入药典的传统液相色谱方法采用的是 4.6*250mm，5μ 的色谱柱，实验所需时间较长及运行成本较高。而在新版 2020 年版药典中，允许色谱参数在一定范围内调整，尤其是允许填料粒径和柱长的变化，这也就官宣 UHPLC 方法正式引入药典、得到药典认可。与 HPLC 方法相比，UHPLC 方法分析速度更快、运行成本更低、检测结果更准确，如图 1 对比所示。

图 1. HPLC 与 UHPLC 方法转换所得结果比对

何为 UHPLC 方法？

所谓的超高效液相色谱（UHPLC）方法实际是使用小粒径（约 2 μm）色谱柱所开发的方法，而可以使用该方法的仪器即为超高效液相色谱仪。所以， UHPLC 方法的关键仅在于色谱柱粒径，与其它参数以及仪器本身无关。

因变化而变革 — L/dp 计算柱效，

促成 UHPLC 引入

在 2020 版药典征求意见稿中，针对色谱柱固定相的要求是不得改变填充剂的理化性质，目的是为了保证色谱柱选择性不变，而全多孔填料与表面多孔填料的转换是被允许的，且规定色谱柱柱长与填充剂粒径的比值（L/dp）仅需在原有数值的 -25%~+50% 之间即可。

2020 版药典征求意见稿允许 L/dp 变化，其实是允许对方法分离度进行微调。如若需要获得与之前完全相同的分离度，则 L/dp 应保持不变；如若此前分离度良好，需缩短分析时间，则 L/dp 最大降低 25%；如若需要借助 UHPLC 方法进一步提高分离度，则 L/dp 最大提升 50%。这说明了在进行 HPLC 到 UHPLC 方法转换时，从色谱柱的角度讲，只有 L 和 dp 一定会发生改变，其它诸如内径等参数都可以保持不变。

Agilent InfinityLab Poroshell 120 色谱柱，采用表面多孔核-壳填料颗粒，可在极低的反压下获得类似于亚 2 μm 填料色谱柱的分离效果。让耐压仅有 400bar、600bar 的老仪器也可开发 UHPLC 方法。谁说老将不能应对新挑战，Poroshell 第一个不干！

图 2. InfinityLab Poroshell 120 色谱柱

HPLC 到 UHPLC，哪些参数需要改变？

填充剂粒径减小，流速增大

流速（F）与色谱柱内径（dc）的平方和填料颗粒粒径（dp）的比值成正比，如公式1。在HPLC到UHPLC方法转换过程中，梯度方法的流速可据此公式转换，而等度方法的流速在此公式的基础上最大可继续变化±50%。也就是说对于梯度方法，如果色谱柱内径保持不变（4.6mm），填料颗粒度下降几倍，流速则要上升几倍，该变化间接说明了小颗粒填料色谱柱更适合于高流速（通常为 2 倍左右），与液相色谱理论中经典的范德姆特方程曲线相符。

图 4 范德姆特方程曲线

色谱柱体积缩短，进样体积减少

进样体积（V_inj）计算公式，实际上是源于色谱柱的体积公式，即与色谱柱柱长和内径平方成正比。随着 UHPLC 色谱柱的使用，色谱柱柱长势必会发生改变。如若色谱柱内径保持不变，色谱柱柱长下降几倍，进样体积也是需要下降相应的倍数，但可依据灵敏度进行一定的调整。

改变色谱柱体积以及流速，需调整梯度洗脱条件

梯度洗脱时间（t_G），与色谱柱体积成正比，与流速成反比，如公式 3。因此在方法转换时，随着色谱柱体积的变化，需对应调整梯度时间表。此外，还需考虑不同系统的体积差异，因此可能涉及到流动相比例的调整，而 2020 版药典分别针对等度与梯度条件对流动相比例也有相应的规定。

安捷伦科技公司强大的 ISET 智能模拟系统，可自动通过模拟目标系统对新方法进行微调，减少流动相比例改动，提高方法转移效率。后面还会有专题介绍这一功（逆）能（天）强（改）大（命）的神器，敬请期待。

还有哪些可调整项？

除色谱柱柱长与填充剂粒径外，2020 年版《中国药典》征求意见稿也针对流动相缓冲液盐浓度比例、pH 值与色谱柱柱温有了一定的规定，均为可调整项，只有检测波长项不允许改变。

药典作为制药行业的指导法典，需要相关从业者认真落实并执行。随着 2020 版药典首次将 UHPLC 技术正式引入，并对其做了极为详尽的方法转换规定，制药行业用户无需再纠结 UHPLC 方法是否合规、是否需要重新验证方法，只需简单的方法确认就可以符合检测要求、满足行业法规，这无疑为广大早已对 UHPLC 技术摩拳擦掌的用户打下一剂有力的强心针。

注：

F₁：原方法中的流速

F₂：调整后方法中的流速

dc₁：原方法中色谱柱的内径

dc₂：调整后方法中色谱柱的内径

dp₁：原方法中色谱柱的粒径

dp₂：调整后方法中色谱柱的粒径

V_inj1：原方法中进样体积

V_inj2：调整后方法中进样体积

L₁：原方法中色谱柱柱长

L₂：调整后方法中色谱柱柱长

t_G1：原方法的梯度段洗脱时间

t_G2：调整后的梯度段洗脱时间

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