Nature Chemistry: 马来酰亚胺-巯基复合物力学拉伸的稳定效应

南京大学的王炜教授、曹毅教授及其研究团队在使用马来酰亚胺-巯基偶联方法稳定蛋白质方面取得重大突破。该研究组使用基于原子力显微镜的单分子力谱技术研究发现马来酰亚胺与巯基结合后通过力学拉伸产生马来酰亚胺开环反应，极大的稳定了马来酰亚胺与巯基的偶联，从而实现将这一简单生化偶联手段用于蛋白质的长期稳定修饰。该研究成果（Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching.）于2019年2月4日发表在《自然·化学》（Nature Chemistry）杂志上（Nature Chemistry. 2019, 11(4):310. doi: 10.1038/s41557-018-0209-2）

马来酰亚胺 – 巯基反应广泛用于治疗用的聚合物修饰蛋白质。然而，马来酰亚胺 - 硫醇反应产物在体内或在含巯基化合物存在的环境中是不稳定的，通迈克尔加成逆反应或巯基交换作用马来酰亚胺-巯基复合物会发生解离。曹毅教授和他的团队使用基于原子力显微镜的单分子力谱技术，研究了马来酰亚胺-巯基复合物在受力下的化学变化。如图1a所示，马来酰亚胺-巯基复合物在受力时会通过逆迈克尔加成反应断裂为原有的反应物。而在水分子的存在下，马来酰亚胺-巯基复合物在受力时，马来酰亚胺五元环通过水解开环，产生力学稳定性更高的复合物。马来酰亚胺-巯基复合物通过碱处理水解开环，力谱实验的结果证实了开环产物有着更高的稳定性，如图1d所示。

图1 

a.马来酰亚胺与巯基发生迈克尔加成反应产物水解开环的示意图。

b. 基于AFM的单分子力谱实验拉伸马来酰亚胺-巯基复合物水解开环的示意图。

c. 单分子力谱的代表曲线。

d. 马来酰亚胺-巯基复合物在含水、无水环境中解离力与碱预处理复合物力解离力统计分布。

在力谱实验中，通过在力学检测之前施加一个预设的拉力并维持一段时间，图2所示随着拉力的增大和拉伸时间的延长，马来酰亚胺-巯基复合物更多的倾向于通过水解开环形成力学稳定性更高的产物。核磁结果表明通过超声打开马来酰亚胺-巯基复合物过程中发生了水解开环反应。进一步，抗体通过马来酰亚胺-巯基反应进行聚乙二醇修饰，之后用超声处理发生水解开环反应。凝胶电泳实验表明，超声处理过的聚乙二醇化抗体有着更高的稳定性，抗降解能力显著增强。

图2 

a. 拉伸预处理时间与马来酰亚胺-巯基复合物解离力的关系。

b. 拉伸预处理力与马来酰亚胺-巯基复合物解离力的关系。

该工作中单分子力谱实验基于Bruker公司的ForceRobot® 300全自动力谱仪完成。

NanoWizard®4 系列、NanoWizard® ULTRA Speed 2以及ForceRobot® 300均可实现高效、精确、定量的单分子力谱实验。配备的高级力谱模块(Advanced Force Spectroscopy module)可以使用户方便的进行力-伸长模式(Force-Extension mode)、力钳模式(Force-Clamp mode)以及反复拉伸等多种复杂的力谱实验设计。 配备的ExperimentPlanner™模块使用户可以调用AFM更多功能进行编程，使研究更加自动化、高效可控。

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Bruker NanoWizard®4 系列介绍：https://china.jpk.com/products/atomic-force-microscopy/nanowizard-4-bioscience

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