Bruker Application Note -原子力显微镜在生命科学领域的应用与进展

AFM分辨率优异且可直接接触样本，但存在短板：无法对表面特征进行化学表征，扫描范围也有限（通常仅100×100平方微米）。这些局限可通过与荧光显微镜等先进光学技术联用解决。基于荧光的光学技术可通过特异性荧光标记，精准识别特定生物分子、细胞结构、细胞器或抗原；同时光学技术视野更广，能先定位目标区域，再通过AFM做精细分析。因此，生物样本成像时，AFM与先进光学显微镜联用已成标配，可实现数据互补与测量关联。

研究分子和细胞动态时，需匹配生物过程的时间尺度（细胞迁移、膜囊泡形成、细胞骨架动态等多发生在秒级、毫秒级），因此工具需兼具高空间分辨率与高时间分辨率。近年高速针尖扫描型AFM取得突破，可解析胞吐、囊泡运输、细胞骨架重构、细胞迁移等秒/毫秒级动态细胞过程，其分辨率突破传统光学衍射极限；此时与光学/荧光检测系统联用，优势会进一步放大。

传统AFM仅能表征单分子、细胞及薄组织切片的纳米力学特性，而生命科学与临床研究对大尺寸、不均一、表面粗糙、难改性的天然样本需求迫切，推动了AFM设备升级。应对大样本横向尺寸问题：可加装电动位移台，结合软件拼接功能，将XY扫描范围拓展至数毫米（采集多幅小范围图像拼接为全景图）；应对大样本高度差超Z轴量程问题：布鲁克推出HybridStage混合平台，整合电动位移台与压电XYZ扫描仪，Z轴量程最高达300微米，主打力谱应用，可实现各类复杂大样本的全面纳米力学表征；另一种方案是布鲁克SmartMapping智能成像技术：基于力成像原理，通过AFM内置Z轴电机拓展压电Z轴的有限量程，且支持自定义2D力成像区域（无需局限于矩形）。

研究生物样本需模拟近生理环境：液相体系、适配的缓冲液成分、盐度、pH值等，还需具备控温能力，适配各类基底与样本。单一环境控制方案无法满足多样化需求，因此生物AFM需配备丰富附加配件，布鲁克就提供生物池、液相池等多款产品。

培养皿：适合细胞培养与固定，是活细胞AFM研究常用载体；布鲁克PetriDishHeater培养皿加热器可适配各类商用35毫米培养皿，控温最高60℃，支持气体交换维持稳定CO₂浓度，满足活细胞长期研究需求。

盖玻片：表面易改性以实现样本固定/功能化，且厚度仅130-170微米，适配高分辨率倒置光学显微镜；但盖玻片易受机械振动干扰，影响AFM测量稳定性，布鲁克BioCell生物池可针对性解决：兼具15-60℃精准控温与毛细管接口，抗振性优异；若振动影响较小，可选用玻璃底培养皿，视野更广、样本容量更大。

DNA是纳米技术核心生物分子，其双螺旋结构具独特结合特性，BioAFM可在液相中实现DNA高分辨率成像，清晰呈现质粒DNA超螺旋状态下的局部解链现象，助力解析转录、复制等DNA/RNA核心生命过程（Fig.8）。

DNA折纸纳米结构（DONs）是优异分子载体，可固定配体用于细胞受体激活、早期信号通路研究，还能构建生物功能材料与生物传感器。借助高速BioAFM（50帧/秒）可实时观测其表面生物分子结合动态，如链霉亲和素-生物素的逐步结合过程，通过量化结合位点占有率，可分析分子结合强度等关键特性，为细胞培养体系研究提供重要工具（Fig.9）。

该技术可研究和操控单分子力学特性，既适用于受体-配体结合、抗原-抗体反应等分子间相互作用，也能解析多结构域蛋白、DNA等分子内相互作用，为理解健康与病变状态下生物分子的生物力学、折叠路径、动力学提供关键依据，有望成为疾病发病机制诊断工具。实验中通过探针与基底固定目标分子，结合连接臂减少干扰，以 (GB1) 8多聚蛋白为例，其解折叠力-距离曲线呈锯齿状，结合蠕虫状链（WLC）模型可提取分子参数；全自动设备（如ForceRobot^®400）日均可获25万条曲线，实现精准统计分析（Fig.10）。

传统AFM接触模式难以适配边缘陡峭、柔软黏附的活细胞，轻敲模式需专业操作，而商用快速力成像技术（如 PeakForce-QI）更适配，通过逐像素采集力曲线将侧向力降至最低。以小鼠NIH-3T3成纤维细胞为例，在37℃培养液中可实现细胞表面断层重建，结合接触力学模型计算杨氏模量，还能通过不同压力下的成像，区分细胞膜（近0pN）与细胞骨架 F-肌动蛋白（300pN）等特定结构，支持原位与离线分析（Fig.11）。

活细胞、组织为复杂不均一材料，传统赫兹力学模型假设不适用，需突破纯弹性分析。通过采集力-距离曲线可观测材料黏性响应，结合Z轴正弦振荡可测量频率依赖的力学响应，计算储能模量（弹性形变）与损耗模量（黏性形变）（Fig.12）。

传统AFM扫描量程不足，难以实现天然大尺寸生物/临床样本的统计性表征，SmartMapping技术结合内置Z轴电机突破Z轴量程限制，搭配电动位移台（20mm×20mm）与光学拼接，可实现大样本纳米力学与光学联合表征。以羊肌肉组织为例，可完成Z轴110μm范围内的力学成像，结合Z轴正弦振荡，能获取频率依赖的储能、损耗模量及损耗角正切值，明确组织黏弹性分布（Fig.13）。

BioAFM可无缝联用光学及超分辨显微镜，结合DirectOverlay等校准技术实现数据精准叠加，融合AFM的形貌、三维结构、力学数据与光学的免疫化学识别信息，实现优势互补。超分辨技术（STED、STORM 等）缩小了与AFM的分辨率差距，DNA纳米结构可作为其校准标准；以DNA纳米尺为例，AFM与STED联用可实现跨技术精准表征，光学端量化荧光分子间距，AFM端获取纳米结构尺寸，二者数据高度吻合，提升表征可靠性支撑（Fig.14）