qPCR引物探针纯度如何评估？Biozen Oligo给出方案

2026-06-15 10:18:51, 市场部飞诺美

在寡核苷酸的应用市场中，诊断行业增长迅速。从核酸检测相关产品和服务的市场规模来看，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）检测占据核酸检测的主导地位，并呈现递增态势，这主要得益于qPCR（实时荧光定量PCR）这一主流技术的发展。qPCR凭借其灵敏、快速和实时定量的特性，已成为分子诊断、病原体检测及基因表达分析的关键技术之一。

荧光探针法qPCR是临床检测中最常用的检测方法，试剂盒中通常包含一对正反向引物及特异性荧光探针。在PCR循环的退火-延伸阶段，引物与模板DNA结合，探针定位于目标序列区域，在延伸过程中通过荧光信号实时反映扩增过程。

引物和探针均为固相合成的单链寡核苷酸，长度通常为18–30个碱基。根据GB/T 34797—2017标准，可采用质谱法或高效液相色谱法进行纯度检测。本文基于Biozen Oligo色谱柱，构建了一套离子对-反相液相色谱（IP-RPLC）方法，实现多种qPCR引物和探针的高效纯度分析。

亮点

Biozen Oligo色谱柱依托核-壳颗粒技术与宽pH稳定性，适于寡核苷酸分析

峰形尖锐对称，分离表现优异

同时适用于多组qPCR引物与荧光探针的纯度评估

TEA-HFIP体系兼顾分离度与质谱兼容性

方法通用性强，适合IVD质量控制场景

实验部分

3.1 样品信息

注：1，2，3代表三种模板基因，F为正向引物，R为反向引物，P为荧光探针

3.2 色谱条件

色谱柱：Biozen Oligo（2.1 × 100 mm, 1.7 μm, 100 Å）；P/N: 00D-4791-AN
流动相：
A：100 mM 六氟异丙醇+ 15 mM 三乙胺
B：甲醇
流速：0.25 mL/min
检测波长：260 nm
柱温：50 ℃
进样量：1 μL（50 nmol）

结果

所有引物以及探针图谱参见图1-9。

图1. 1-F谱图（右图为局部放大）

图2. 1-R谱图（右图为局部放大）

图3. 1-P谱图（右图为局部放大）

图4. 2-F谱图（右图为局部放大）

图5. 2-R谱图（右图为局部放大）

图6. 2-P谱图（右图为局部放大）

图7. 3-F谱图（右图为局部放大）

图8. 3-R谱图（右图为局部放大）

图9. 3-P谱图（右图为局部放大）

引物、探针纯度分析结果

结论

本文使用Biozen Oligo（2.1 × 100 mm，1.7 μm，100 Å）对qPCR引物和探针进行质量评估。通过保留时间很好的区分引物的差异，结合纯度的结果快速识别引物的质量。该方法通用性强，可满足多种引物和探针的纯度检测需求。采用TEA-HFIP体系作为流动相，不仅具有优异的灵敏度和分离度，同时兼具质谱兼容性，便于后续进行分子量测定等定性分析。

如果您在引物/探针分析方法开发或优化过程中遇到挑战，欢迎联系飞诺美技术支持团队，我们将为您提供专业的应用支持与解决方案。