核酸药物研发：SCIEX X500高分辨质谱赋能寡核苷酸的高效表征与杂质分析

2026-06-24 14:28:54, SCIEX SCIEX

背景知识

寡核苷酸药物（如siRNA、ASO、mRNA等）近年来在重大疾病治疗领域展现出巨大潜力，但其序列长、修饰多、电荷分布复杂等特点，对分析平台的分辨率、灵敏度及数据处理能力提出了远超传统小分子药物的严苛要求。寡核苷酸药物的分析难点集中体现在三个方面：一是多电荷分布（通常-4至-11价）要求质谱具备宽动态范围和高分辨能力；二是多种化学修饰（如硫代磷酸酯、2''-氟、2''-O-甲基）共存时，需精确区分并定位修饰位点；三是合成与储存过程中产生的脱硫产物、短链缺失（n-1、n-2）、环化产物等杂质种类繁多、丰度差异大，对仪器的灵敏度和选择性提出了极高要求。如何在复杂基质中精准确认分子量、完整验证修饰序列、并全面识别低丰度工艺杂质与降解产物，已成为核酸药物研发与质量控制的核心技术瓶颈。

SCIEX X500B QTOF系统正是为解决这些难点而设计。该系统集成了高分辨率、亚ppm级质量精度、智能IDA采集模式及高耐受Turbo V离子源等核心技术，配合Molecule Profiler（MP）自动化软件平台，能够完整覆盖寡核苷酸分析从数据采集到结果输出的全流程需求。本文以全球首款靶向PCSK9的siRNA长效降脂药物Inclisiran的反义链为典型案例，系统展示X500B QTOF在分子量确认、序列确证、杂质鉴定及相对定量分析中的完整工作流程与技术优势。

方法与策略：从液相分离到质谱解析的全流程设计

采用ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18色谱柱，以DIPEA/HFIP为流动相体系，有效减少金属离子加合物干扰，15分钟内完成梯度洗脱。X500B QTOF在负离子模式下进行IDA采集：Turbo V离子源在高盐流动相中依然保持稳定的离子化效率；IDA模式实时监测MS信号，自动选择母离子进行二级碎裂，确保低丰度杂质也能被捕获。MP软件则在后端承担序列建库、电荷去卷积、碎片标注及修饰定位的全自动化处理，将传统手动分析所需数小时压缩至数分钟。

结果与讨论：以Inclisiran反义链为例的完整表征

分子量确认

使用X500B QTOF的IDA模式采集样品，样品在8.5-9.5min出峰，TOF MS显示-8、-9、-10价为最主要的电荷状态。解卷积后主峰分子量7698 Da，与理论值高度吻合。同时，解卷积谱中识别出7681 Da、6961 Da、7338 Da等杂质峰（图1）。X500B QTOF的高分辨率能清晰区分相差16 Da（脱硫）或359 Da（n-1缺失）的质量差异，宽动态范围确保主峰与杂质峰在同一谱图中均可准确定量。

图1. Inclisiran反义链样本质谱采集图谱

序列确证

在MP软件的Compound Library模块中输入Inclisiran反义链的理论序列，并上传质谱IDA采集数据完成建库（图2）。利用MP软件的鉴定结果，将序列与parent组分的二级MS/MS进行匹配，结果显示序列覆盖度达到100%，其中d、w、y等离子的匹配信息清晰可辨，证实了该样本主要成分与理论序列完全一致。值得一提的是，X500B QTOF的高能碰撞池（CID）可产生丰富且均匀的碎片离子，配合MP软件的全自动标注，极大提升了序列确证的效率与准确性（图3）。

图2. SCIEX Molecule Profiler软件核酸分析方法建立

图3. Inclisiran反义链样本序列确证

杂质鉴定

MP软件鉴定出7681.80 Da杂质为Desulfurization产物（硫代磷酸酯氧化为磷酸二酯键），并通过d、w离子信息将修饰丢失定位至mA*、fC*、mG*等位点。7338.61 Da杂质被确认为3'' (n-1)缺失产物（3''端mA丢失）。此外还鉴定出5'' (n-2)、5'' (n-3)缺失产物及3'' (n-2)环化产物等（图4）。X500B QTOF的亚ppm级质量精度确保不同长度片段准确区分。相对定量显示主药纯度为75.1%，Desulfurization产物为主要杂质（7.1%），其余杂质均低于5%。虽为半定量，但无需标准品即可快速评估纯度趋势，尤其适用于早期工艺开发。