实验指南 | 类器官染色：如何选择荧光染料？

🧠 类器官研究必看｜荧光染料别瞎用！本期：1️⃣在类器官研究中，应该如何选择合适的荧光染料？2️⃣类器官染色实验和细胞染色实验的区别在哪？3️⃣不同应用场景下，又有哪些值得关注的染料方案？速戳解锁👇

Section.01

类器官染色

类器官 (organoid) 指的是由干细胞或组织来源细胞在体外培养形成的三维结构，作为一种新兴的体外模型，类器官正在改变传统生命科学研究的方式。

相比传统的二维细胞培养模型，类器官不仅保留了细胞间的空间组织关系，还能够更真实地反映组织的异质性和生理状态，因此在疾病模型构建、药物筛选以及精准医疗等领域展现出显著优势。

图 1. 类器官与其他模型系统的比较^[1]。

类器官是包含空间分层、细胞异质性以及功能分区的复杂系统，获取结构信息 (在哪里) 与功能信息 (在做什么) 是非常重要且有挑战性的工作。

荧光成像正是实现这一目标的核心工具：

• 多色标记可以解析不同细胞群体在三维空间中的分布关系；

• 功能型探针可以揭示不同区域的代谢状态或信号活性；

• 时间序列成像则可以追踪类器官在发育、响应或病理过程中的动态演变。

荧光技术并不仅仅能实现“看见类器官”，更关键的是能系统性地读取其中蕴含的多维生物学信息。

图 2. Calcein-AM 和 PI 染色的类器官，分别对应活细胞区域和死细胞区域^[2]。

然而，随着研究模型从二维平面转向三维立体，类器官较大的体积、致密的内部结构与复杂的三维空间组织，也带来了新的挑战——传统二维体系中成熟的荧光染料与成像策略，并不一定适用于类器官染色实验。

接下来，我们将对类器官荧光成像实验中的难点展开详细分析!

Section.02

   类器官的荧光成像：

难点和解决策略

类器官系统中致密的三维结构会显著限制荧光探针的扩散，尤其在体积较大的类器官中，染料更容易停滞在外围区域，中心区域可能出现染色不足甚至无信号的情况。

关注染料的组织渗透性，分子量较小、膜通透性更好的荧光探针通常更容易扩散进入类器官内部，从而实现更均匀的整体标记。

类器官内部结构复杂且不均匀，激发光和发射光在传播过程中容易发生散射和吸收，导致深层组织的荧光信号减弱，难以准确获取内部区域的信息。

选择高亮度、高信噪比、波长靠近红外区域的荧光染料，在较低激发强度下获得更强信号，减少背景干扰并提升深层成像能力。

类器官研究往往对长期观察有要求，但连续激发引发光漂白导致信号逐渐减弱，持续光照诱导 ROS 生成影响类器官状态，都是动态检测需要考虑的问题。

选择生物兼容性好、光稳定性优的染料，提前做好预实验再开展正式长期观察，避免浪费样本。

类器官的培养高度依赖基质胶等外部材料，其自发荧光会带来不可忽视的背景信号，实际成像中可能荧光信号看起来很亮，但其实信息并不准确来源于类器官本体。

优先选择近红外波段的染料，减少与自发荧光的重叠；优化培养体系降低自发荧光，必要时引入自发荧光淬灭试剂降低背景噪音。

学习完了理论知识，接下来直接上干货，下面的表格总结了常见的类器官染料和应用场景，大家可以按需选择~

表 1. 类器官染料推荐。

Section.03

类器官染色:应用场景

荧光成像让类器官从静态培养模型升级为可动态解析的功能模型，接下来我们结合两个经典的应用场景，解析类器官染色实验在实际场景中的价值。

药物筛选是目前类器官最核心、也是最成熟的应用方向之一。

传统明场观察往往难以准确区分类器官内部的存活区域和死亡区域，药物处理导致的细胞碎片、结构塌陷也容易影响判断，而活死细胞荧光染色可以很好地将难以量化的药物响应转化为可数据分析的荧光信号。

随着高内涵成像技术的发展，荧光成像已经不仅局限于活死分析，还能够进一步获取类器官大小、形态、细胞分布以及药物响应异质性等多维信息，在单个类器官水平上解析不同药物响应模式。下面这一项研究结合三种不同的染料分子，实现了同时对类器官结构 (Hoechst 33342)、凋亡过程 (Caspase-3/7荧光底物) 和类器官最终死亡情况 (TO-PRO-3) 的原位可视化^[3]。

图 3. 实验阳性对照和阴性对照的明场和荧光图像^[3]。

Hoechst 33342 识别所有细胞，Caspase-3/7 荧光底物识别凋亡细胞，TO-PRO-3 识别所有死亡细胞。

相比传统二维细胞模型，类器官能够更真实地保留组织结构和疾病相关特征，通过荧光成像和动态观察，不仅能实现对类器官整体形态变化的观察，还可以进一步追踪细胞的分化和代谢状态。

前文已经强调，类器官较大的体积和内部光散射对荧光成像实验影响较大，因此下面介绍的这篇文献中巧妙引入了双光子荧光寿命成像 (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) 技术，一方面双光子激发可以提高光穿透能力，降低长时间成像光毒性；另一方面荧光寿命对信号衰减相对不敏感，能提供更稳定的信息输出^[4]。

作者设计使用 Hoechst 33342对细胞核进行荧光标记，同时将细胞增殖的经典标志物 BrdU 掺入复制中的 DNA。BrdU 的积累会导致 Hoechst 荧光发生淬灭，导致其荧光寿命明显缩短。对类器官染色的 FLIM 图像进行 3D 重建数据分析，结果显示荧光寿命较短的区域主要对应干细胞富集区域，即增殖状态；而荧光寿命较长的区域则主要对应已经分化或处于静息状态的细胞，即成熟状态。这样的应用使得 Hoechst-BrdU 不仅仅是对细胞核进行荧光标记的染料，更是反映细胞周期状态的功能性探针。

图 4. Hoechst-BrdU 染色类器官双光子荧光寿命成像 (FLIM) 的三维重建^[4]。

荧光寿命较短的区域对应类器官内部增殖状态，荧光寿命较长的区域对应类器官内部休眠或成熟状态。

Section.04

小结

随着类器官技术的持续发展，荧光染料的功能定位正逐步拓展。从早期仅用于细胞结构的简单染色，到如今能够实时追踪细胞代谢、增殖、分化及动态行为，荧光成像已逐渐成为类器官研究领域的核心技术之一。与此同时，类器官模型对荧光染料也提出了更高标准，优异的荧光亮度与稳定性、低细胞毒性、深层组织穿透能力以及与先进成像技术的兼容性等，均是类器官染料研发与应用中需重点考量的关键要素。可以预见，随着相关技术的不断进步，荧光染料将在类器官研究中发挥愈发重要的作用，为疾病机制解析与精准医学发展提供有力支撑。

产品推荐

上下滑动查看更多

Calcein-AM (HY-D0041) Calcein AM 本身并无荧光，进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解生成具有强负电荷的不能通透细胞膜的极性分子钙黄绿素 (Calcein)，从而被滞留在细胞内，常用于细胞活力/毒性检测。

Propidium Iodide (HY-D0815) 溴化乙啶的类似物，在嵌入双链 DNA 后释放红色荧光。Propidium lodide不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。常用于细胞凋亡或坏死检测。

EthD-1 (HY-D0093) 高亲和性的荧光核酸染料，常用于哺乳动物、细菌、酵母和真菌的染色。

Hoechst 33342 (HY-15559) 通过结合 DNA 双链中的小沟而结合核酸，倾向于结合富含A/T的 DNA 链。Hoechst 33342可穿过细胞膜，结合活细胞或固定细胞。

H2DCFDA (HY-D0940) 可渗透细胞的，用于检测细胞内活性氧 (ROS) 的探针。

MitoTracker Deep Red FM (HY-D1783) 远红色荧光染料，可以选择性地积聚在线粒体基质中。

JC-1 (HY-15534) 以电势依赖性的方式积聚在线粒体内，可以用来检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。

Fluo-4 AM (HY-101896) 常用的检测细胞内钙离子浓度的探针。

[1] Liu GH, et al. A narrative review of organoids for investigatingorgan aging: opportunities and challenges. J Bio-X Res. 2023 May 23; 06 (01)

[2] Garnier G et al. Cationic Cross-Linked Nanocellulose-Based Matrices for the Growth and Recovery of Intestinal Organoids. Biomacromolecules. 2021 Feb 8;22(2):701-709.

[3] Salahudeen AA et al. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 2022 May 18;3(2):101407. 

[4] Dmitriev RI et al. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Methods Mol Biol. 2020;2171:65-97.