利用安捷伦 Seahorse XF Flex 3D 捕获微孔板-S 改进胰岛和细胞球的实时代谢分析

2026-06-25 11:50:57 安捷伦细胞分析事业部（BioTek）

前言

安捷伦 Seahorse XF 技术是一体化的无标记检测平台，可用于实时功能性代谢分析，并提供耗氧率 (OCR) 和细胞外酸化率 (ECAR) 等关键参数，这些参数是了解线粒体健康状况、毒性效应、糖酵解和细胞功能（障碍）的重要指标。安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪具有更高的灵敏度和精度、更宽的检测范围以及为优化工作流程设计的专用消耗品，适用于三维 (3D) 研究模型（如组织、类器官和共培养材料）。

在本技术概述中，我们介绍了一种用于胰岛代谢分析的优化工作流程，该流程使用 Seahorse XF Flex 分析仪和安捷伦 Seahorse XF Flex 3D 捕获微孔板-S，可提高灵敏度并减少样品需求量。通过该工作流程可以获得有关驱动胰岛素分泌及影响胰岛整体健康状况的关键能量通路的数据，帮助研究人员深入了解胰岛的葡萄糖响应性、线粒体效率及胰岛细胞群的功能异质性。这些研究数据有助于识别功能异常的胰岛、优化培养条件、评估治疗干预措施，从而推进糖尿病研究、改善胰岛移植结果，并促进靶向疗法的开发。此外，该工作流程还适用于小型多球样本，使其在 3D 代谢分析领域具有更广阔的应用前景。

图 1. 使用安捷伦 Seahorse XF 3D 捕获微孔板-S 的胰岛工作流程。将胰岛加入 XF 3D 捕获微孔板-S 的样品室中，然后利用专为小型 3D 样本优化的具有独特设计的捕获筛网进行固定

胰岛 XF 检测工作流程

图 1 所示的检测工作流程概述了对胰岛样本进行安捷伦 Seahorse XF 检测的关键步骤，包括样本前处理、检测板组装及所需材料。以下各小节将详细介绍每个步骤。您也可以根据具体的研究目标，对该工作流程进行调整。

检测流程

实验前一天

水化探针板并放入 37 °C 无 CO₂ 培养箱。将 XF 3D 捕获微孔板-S 和筛网放入 37 °C 无 CO₂ 培养箱中过夜，以进行脱气。

分离胰岛

根据实验室的方案准备完整的胰岛，并在标准胰岛培养条件下过夜恢复^[1-3]。本研究使用的胰岛购自 Prodo Laboratories 或乔斯林糖尿病中心，分离自五只 8 至 12 周龄的 Sprague Dawley 雄性大鼠。Prodo labs 提供的胰岛在混合后恢复 36 小时，然后使用 PIMT 培养基 (Prodo Laboratories) 在 6–10 °C 条件下冷链过夜运输。抵达后，使用 PIM(R) 培养基清洗胰岛，离心后使用完全 PIM(R) 培养基重悬（浓度为 2500 IEQ/10 mL）。乔斯林糖尿病中心的胰岛在分离当日运输，使用的培养基为含谷氨酰胺、10% 胎牛血清 (FCS) 和 1% 青霉素/链霉素的 RPMI 1640，全程置于冰上运输。抵达后，以 100 个胰岛/mL 的浓度接种到相同的培养基中。在进行 XF 检测前，将这些胰岛在未经组织培养处理的培养皿中，于 37 °C 5% CO₂ 条件下恢复过夜。

制备肿瘤球

将 HCT116-H2B-GFP 细胞在添加了 10% 胎牛血清 (FBS)、 2 mM 谷氨酰胺及青霉素/ 链霉素的 Advanced DMEM (Dulbecco''s Modified Eagles Medium) 中维持培养。将细胞在37 °C、含 5% CO₂ 的加湿培养箱中维持培养，并在 80% 汇合度下常规传代。将细胞接种到 6 孔 Elplasia 圆底板 (Corning) 中，每孔 200 个细胞，以制备 HCT116-H2B-GFP 细胞球。将细胞球培养 6–7 天，使直径达到约 150 µm，然后用于实验检测。

实验当天：胰岛工作流程

配制胰岛 XF 检测液

根据表 1，配制 100 mL 安捷伦 Seahorse XF DMEM pH 7.4 检测液，其中含 2.5 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸钠。取 50 mL 转移至新的 50 mL 离心管中，用于配制化合物溶液以及捕获筛网的预润湿。向剩余的检测液中加入不含脂肪酸的牛血清白蛋白 (BSA)，使其终浓度达到 0.2%（表 2）。将所有检测液预热至 37 °C。

表 1. 安捷伦 Seahorse XF 检测液（不含 BSA）

试剂	货号	[最终浓度] (mM)	体积 (mL)
XF DMEM 培养基，pH 7.4	103575-100	-	100
XF 1.0 M 葡萄糖溶液	103577-100	2.5	0.25
XF 200 mM 谷氨酰胺溶液	103578-100	2	1.0
XF 100 mM 丙酮酸钠溶液	103579-100	1	1.0

表 2. 配制 0.2% BSA 检测液

试剂	最终含量 (%)	储备液 (%)	体积 (mL)
Seahorse XF 检测液（表 1）	-	-	50
100 mg/mL BSA（不含脂肪酸）	0.2	10	1.0

准备用于胰岛的

Seahorse XF Flex 3D 捕获微孔板-S

在 60 mm 培养皿中，用不含 BSA 的 XF 检测液对捕获环进行预润湿。用镊子将捕获环推入检测液中，网面朝下，如有必要，去除气泡。向 XF 3D 捕获微孔板-S 的每个孔中加入 525 µL 0.2% BSA 检测液，然后放回无 CO₂ 培养箱中，直到准备好向板中接种胰岛。

向一个 60 mm 培养皿（无菌，未经处理）中加入 6 mL 0.2% BSA 检测液。然后，使用该检测液预先润湿移液枪头和其他塑料制品，防止胰岛粘附在移液枪头和其他塑料制品的表面上。接着，从原培养板中收集足够数量的胰岛用于实验：首先在超净台内轻轻旋转原培养板，使胰岛聚集到中央，然后用预先润湿的移液枪头吸取胰岛，转移到含有 6 mL 0.2% BSA 检测液的 60 mm 培养皿中。或者，也可从培养皿中收集胰岛：根据胰岛浓度，吸取适量的胰岛培养物，移入 15 mL 离心管中。让胰岛在重力作用下沉降，或在 200 x g 下离心两分钟。去除维持培养基，将胰岛重悬于 0.2% BSA 检测液中，并置于未经处理的 60 mm 培养皿中。

在显微镜下，使用预先润湿的 P10 移液器从培养皿中收集胰岛（吸取 4–10 µL 检测液），确保选取的胰岛大小均匀。然后将胰岛转移至捕获板中，将移液枪头穿过检测液置于孔底中心，缓慢地将胰岛推入中央腔室。在重力作用下，胰岛会沿着枪头的方向下落；缓慢排出可确保胰岛保持在中央位置。请勿向 A1和 D6 孔中加入胰岛，这两个背景孔只需加入检测液即可。

提示：开始推出液体时，胰岛即会从枪头中推出。切勿完全推尽液体或将空气推入孔中。吸取胰岛前务必先润湿枪头并确保枪头内无气泡。

使用安捷伦 Seahorse XF 3D 捕获筛网插入工具或镊子，将预润湿的捕获环轻压装入所有孔中，包括背景孔。将孔板置于37 ° C 无 CO₂ 培养箱中孵育 30–45 分钟，然后进行检测。建议对样本进行成像（明场），评估胰岛的位置是否合适。

图 2. 安装捕获筛网

利用胰岛进行 Seahorse XF 线粒体压力测试

准备传感器探针板以及配制安捷伦 Seahorse XF 线粒体压力测试化合物溶液，具体方法参阅安捷伦 Seahorse XF 3D 线粒体压力测试试剂盒用户指南。下表 3 和表 4 概述了储备液和加样溶液的配制方法。使用不含 BSA 的 Seahorse 胰岛 XF 检测缓冲液（表 1）配制所有化合物加样溶液。通过稀释 Seahorse XF 1.0 M 葡萄糖溶液（用于胰岛线粒体压力测试的首次加药或急性加药）配制葡萄糖加样溶液。

在将化合物加入探针板的加药口之前，务必先移除水化辅助板。

表 3. 使用安捷伦 Seahorse XF 3D 线粒体压力测试试剂盒配制储备液

试剂	加入的体积 (mL)	储备液 (µM)
寡霉素 A	2.7	270
FCCP	2.7	200
鱼藤酮/抗霉素 A	2.7	110

表 4. 每孔起始溶液体积为 525 µL 时，加样溶液的配制方案

加样溶液	储备液 (µL)	检测液 (µL)	加药口和体积	[孔内终浓度] (µM)
葡萄糖 (8 x)	341（1 M 储备液）	2659	加药口 A：75 µL	16700 (+ 14200)
寡霉素 A (9 x)	500	2500	加药口 B：75 µL	5
FCCP (10 x)	450	2550	加药口 C：75 µL	3
*Rot/AA (11 x)	1500	1500	加药口 D：75 µL	5

安捷伦 Seahorse Wave Controller 软件中提供的 XF 胰岛线粒体压力测试（急性）检测模板针对胰岛样本进行了优化，默认设置为每个循环混合 3 分钟，等待 0 分钟，测量 3 分钟。循环次数设定为：基础测量 4 次，加入葡萄糖后 6 次，加入寡霉素 A 后 6 次，加入 FCCP 后 3 次，加入鱼藤酮/抗霉素 A 后 6 次。可在最后一个加药口中加入 Hoechst 染料，终浓度为2 μM，以便在检测完成后对胰岛进行荧光成像。

运行 XF 胰岛线粒体压力测试（急性）实验时，在 XF Flex Controller 软件的可用模板列表中选择 XF 胰岛线粒体压力测试（急性）检测模板。检查实验的分组（细胞类型或条件）、孔板布局图和仪器运行方案，可根据需要进行调整。在查看和运行界面中，单击 Scan Assay Kit（扫描检测试剂盒），以显示检测试剂盒信息对话框。若配备手持式外部条形码扫描器，请直接扫描试剂盒外部标签上的条形码。检测试剂盒的货号和批号信息会自动添加进对话框中。否则，请手动输入试剂盒信息。在 SW ID 字段中，手动输入试剂盒标签上的软件代码。单击 Apply（应用）。软件将会把这些信息加入到数据文件中。单击 Start Run（开始运行），开始检测。出现提示时，请取下探针板盖子，然后将带有水化板的已加药的传感器探针板置于热托盘上。确保孔板的放置方向正确，且已移除探针板盖子和水化辅助板。然后，单击 I’ m Ready（准备完毕）。校准大约需要 15 至 20 分钟。校准完成后，单击 Open Tray（打开托盘）以弹出水化板，然后放入细胞板。放入细胞板前确保盖子已取下。单击 Load Cell Plate（加载细胞板）开始运行检测。

实验当天：细胞球工作流程

配制用于细胞球的 XF 检测液

根据表 1 配制 100 mL 安捷伦 Seahorse XF DMEM 检测液，但葡萄糖的浓度有所不同，因为细胞球需要的浓度为 10 mM ，而不是 2.5 mM。将检测液加热至 37 °C。

准备用于细胞球的

Seahorse XF Flex 3D 微孔板

从 Eplasia 培养板中收集细胞球：用 3 mL XF 检测液轻柔清洗，转移至 15 mL 锥形管中，使其在重力作用下自然沉降（这可能需要 15 到 20 分钟）。缓慢移除大部分检测液，保留约 500 µL，以尽量减少对细胞球的扰动。用 5 mL XF 检测液重悬细胞球，然后转移至未包被的 60 mm 培养皿中，随后按上述胰岛操作流程，直接手动吸取至 XF 3D 捕获微孔板中。

向捕获板每个孔中加入 600 µL XF 检测液。在显微镜下，使用预先润湿的 P10 移液器从培养皿中收集所需数量的细胞球（吸取 4–10 µL 检测液）。请勿向 A1 和 D6 孔中加入细胞球，这两个背景孔只需加入检测液即可。之后，按照胰岛实验的操作说明，向所有孔中装入预湿润的 3D 捕获环。

利用细胞球进行

Seahorse XF 3D 线粒体压力测试

本研究使用了安捷伦 Seahorse XF 细胞线粒体压力测试试剂盒（货号 103015-100），因为该试剂盒提供的化合物量足以满足 HCT116-H2B-GFP 细胞球（约 150 µm）的检测需求。按照表 5 和表 6，使用检测液配制所有化合物的溶液。在将化合物加入探针板的加药口之前，务必先移除水化辅助板。

表 5. 使用安捷伦 Seahorse XF 细胞线粒体压力测试试剂盒配制储备液

化合物	加入的体积 (µL)	储备液 (µM)
寡霉素	630	100
FCCP	720	100
鱼藤酮/抗霉素 A	540	50

表 6. 每孔起始溶液体积为 600 µL 时，加药溶液的配制方案

加样溶液	储备液 (µL)	检测液 (µL)	加药口和体积	[孔内终浓度] (µM)
寡霉素 (9 x)	621	1679	加药口 B：75 µL	3
FCCP (10 x)	230	2070	加药口 C：75 µL	1
*Rot/AA (11 x)	506	1794	加药口 D：75 µL	1

采用安捷伦 Seahorse Wave Controller 软件中的 3D 线粒体压力测试模板，并调整循环次数。该模板针对 3D 样本进行了优化，默认设置为每个循环混合 3 分钟，等待 0 分钟，测量 3 分钟。将循环次数调整为：基础测量 3 到 4 次，加入寡霉素后 8 次，加入 FCCP 后 3 次，加入鱼藤酮/抗霉素 A 后 6 次。可在最后一个加药口中加入 Hoechst 染料，终浓度为 2 μM ，以便在检测完成后对细胞球进行荧光成像。

按照胰岛工作流程中的操作说明运行并完成 XF 线粒体压力测试。

实验当天：成像

在 XF 实验前后，使用安捷伦 BioTek Lionheart 或 Cytation 成像系统，采集 4 倍放大下的明场和荧光图像，用于评估样本的位置是否合适以及用于数据归一化。

XF 3D 线粒体压力测试数据分析

使用网页软件平台 Seahorse Analytics 对 XF 3D 线粒体压力测试结果文件进行分析。使用 Seahorse Analytics 中的 XF 3D 线粒体压力测试助手视图，可以自动计算关键检测参数，并以图表形式呈现。

材料和设备

表 7. 工作流程中使用的材料和设备

材料	供应商	货号
Seahorse XF Flex 3D 捕获 FluxPak-S	安捷伦科技公司	103874-100
Seahorse XF 3D 捕获筛网插入工具		103873-100
Seahorse XF 3D 线粒体压力测试试剂盒		103016-100
Seahorse XF 细胞线粒体压力测试试剂盒		103015-100
Seahorse XF DMEM pH7.4		103575-100
Seahorse XF 1.0 M 葡萄糖溶液		103577-100
Seahorse XF 100 mM 丙酮酸钠溶液		103578-100
Seahorse XF 200 mM 谷氨酰胺溶液		103579-100
Seahorse XF Flex 分析仪		S7851A 或 S7851AN
Cytation 成像系统		XXXXX
Lionheart 成像系统		XXXXX

系统性能评估

胰岛实验

使用来自野生型雄性 Sprague Dawley 大鼠的 20 个胰岛进行 XF 线粒体压力测试，典型结果如图 3 所示。该实验是评估线粒体健康状况的金标准，可提供反映线粒体功能的多项参数，包括基础呼吸、 ATP 关联呼吸、最大呼吸能力和储备呼吸能力，以及非线粒体呼吸。

实验方案中增加了葡萄糖的急性加药步骤。如图 3A 所示，胰岛样本对所有线粒体调节剂以及 16.7 mM 高浓度葡萄糖均表现出强烈的耗氧率 (OCR) 响应。对照组（未加入化合物）稳定的 OCR 信号表明，在整个检测过程中胰岛均保持健康状态。

整体的 ECAR 信号较低，表明样本的糖酵解活性较低（图 3B）。加入葡萄糖和 FCCP 后出现的 ECAR 信号升高，可能是由于线粒体产生的 CO₂ 引起的，而非糖酵解作用，因为 ECAR 和 OCR 的变化趋势相似，且使用寡霉素或鱼藤酮/抗霉素 A 抑制线粒体功能后，ECAR 随之降低。这些实验结果与胰岛组织高氧化代谢特性及低糖酵解活性的生物学特征相符。

图 3. 使用安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪搭配安捷伦 Seahorse XF 3D 捕获微孔板-S 进行安捷伦 Seahorse XF 线粒体压力测试的典型结果，每孔 20 个胰岛。A. OCR 动力学曲线。B. ECAR 动力学曲线。C. XF 线粒体压力测试报告的参数

来自同一胰腺的胰岛大小不一，且表现出不同的代谢特性。它们对葡萄糖的敏感性存在差异，而线粒体呼吸在葡萄糖刺激的胰岛素分泌中起着关键作用。在 XF 胰岛工作流程中，必须手动挑选大小一致的胰岛并确保数量一致，并将它们直接放置在 XF 3D 捕获微孔板-S 的样品室中央位置。为确保下游代谢分析结果的准确性和可靠性，应避免使用具有坏死核心的大体积胰岛，以免影响代谢测量结果。

在实验优化阶段，我们评估了每孔加入不同数量的胰岛（5、10、20 和 40）时的效果。如图 4A 所示，在每孔 5–40 个胰岛的范围内，基础 OCR 与胰岛数量之间呈现良好的相关性，只需 10–20 个胰岛就足以产生较强的 OCR 信号 (70–100 pmol/min)。在实际检测中，应根据所用胰岛的具体类型和制备方式优化所需的数量。图 4B 展示了在检测后对孔中的染色胰岛进行成像获得的代表性图像。

图 4. A. OCR 与每孔胰岛数量之间的相关性。B. Seahorse XF 检测后，在安捷伦 Seahorse XF 3D 捕获微孔板-S 中获得的捕获筛网下经 Hoechst 染色的胰岛的图像

图 5. 使用安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪搭配安捷伦 Seahorse 3D 捕获微孔板-S 和安捷伦 Seahorse XFe24 分析仪搭配安捷伦 Seahorse XF 胰岛捕获微孔板，在每孔的大鼠胰岛数量不同的情况下测得的基础 OCR 的比较

我们还比较了使用 XF Flex 分析仪搭配 XF 3D 捕获微孔板-S 与安捷伦 Seahorse XFe24 分析仪搭配 Agilent XF24 胰岛捕获微孔板的检测性能。如图 5 所示，使用 XF Flex 分析仪搭配 XF 3D 捕获微孔板-S 时，基础 OCR 要高得多。在 XF Flex 系统中，10–20 个胰岛的基础 OCR 约为 100–200 pmol/min；而在 XFe24 系统中，则需要 40 个胰岛才能获得 100 pmol/min 的基础 OCR，这清楚地表明 XF Flex 系统的灵敏度更高。图 6 展示了两套系统的完整 XF 线粒体压力测试动力学曲线。

除了胰岛数量外，还应评估化合物剂量，以确定最佳浓度。这取决于检测液组成（是否含 BSA 或 FBS）、胰岛来源、大小及每孔数量。此处以确定最佳 FCCP 浓度为例：在加入16.7 mM 葡萄糖和 5 µM 寡霉素 A 后，通过两次连续加药加入不同剂量的 FCCP。该策略能够通过更少的孔和胰岛实现更宽范围的剂量测试。在图 7 中，我们比较了加入 FCCP （最终FCCP 浓度为 1、2、3、4、 5 或 8 µM）后的最大 OCR 百分比。数据表明，2–4 µM 的浓度可获得相似的最大 OCR，其中 3 µM 浓度下的结果重现性更好（图 7B）。因此，确定最佳 FCCP 浓度为 3 µM。此外，胰岛实验使用的寡霉素和鱼藤酮/抗霉素 A 的浓度均为 5 µM。

图 6. 每孔 5、10、20 和 40 个大鼠胰岛的情况下，安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪搭配安捷伦 Seahorse 3D 捕获微孔板-S (A) 与安捷伦 Seahorse XFe24 分析仪搭配安捷伦 Seahorse XF 胰岛捕获微孔板 (B) 的检测性能比较

图 7. 采用顺序加药策略对大鼠胰岛进行 FCCP 剂量优化。A. 以第 10 次测量（加入寡霉素 A 前的最后一次测量）进行基线归一化的 OCR 百分比动力学曲线图。 B. 加入不同浓度 FCCP 后最大 OCR 百分比的柱状图（每次加入 FCCP 后的第二次测量）

细胞球实验

使用培养了 7 天的 HCT116-H2B-GFP 细胞球（平均直径150 µm ，20 个细胞球体/孔）进行 XF 线粒体压力测试，结果如图 8 所示。可以看出，基础 OCR 较高，约为 200 pmol/min。细胞球对所有三种调节剂均表现出明显的响应。与胰岛实验一样，加入寡霉素后需要更多的测量循环才能达到平台期。在此示例中，设置了八个测量循环，但可以根据实验使用的细胞球数量、大小和类型进行调整。

HCT116-H2B-GFP 细胞球为均质样本，获得的信号非常稳定（第 3 次测量的基础 OCR CV 为 7%）。使用 SHA 软件获得所有反映线粒体功能的关键参数（图 8C）。

图 8. 使用安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪搭配安捷伦 Seahorse XF 3D 捕获微孔板-S，对 HCT116-H2B-GFP 细胞球 (20) 进行安捷伦 Seahorse XF 线粒体压力测试的结果。A. OCR 动力学曲线。B. ECAR 动力学曲线。C. XF 线粒体压力测试报告的参数

ECAR 整体都较低，但 ECAR 动力学曲线与 OCR 动力学曲线的变化并不同步。当用寡霉素抑制 ATP 合酶时，会观察到 ECAR出现代偿性升高。加入鱼藤酮/抗霉素 A 后， ECAR 仍能维持该升高状态，表明 ECAR 活性增加与线粒体呼吸无关，而可能是糖酵解上调的结果，以补偿通过线粒体呼吸产生 ATP 的能力的丧失。

在实验优化阶段，我们采用 XF 3D 捕获微孔板-S 对不同数量的 HCT116-H2B-GFP 细胞球（每孔 10、20、40 和 60 个）进行了评估。如图 9 所示，在 10–60 个细胞球范围内呈线性关系，R² 为 0.95。这种强相关性和低变异性得益于细胞球的高度均质性。图 9B 展示了在检测后对孔中的染色细胞球进行成像获得的代表性图像。

XF 3D 捕获微孔板-S 每个孔的底部设有一个深度为 250 µm 的样品室，并配有一个孔径为 170 µm 的捕获筛网。在本研究中，我们使用的细胞球直径约为 150 µm，该微孔板支持的细胞球尺寸范围为 150–300 µm。

图 9. 使用不同数量的 HCT116-H2B-GFP 细胞球进行基础 OCR 测量。A. OCR 与每孔细胞球数量之间的相关性。B. 安捷伦 Seahorse XF 检测后，获得的捕获筛网下经 Hoechst 染料染色的细胞球图像

我们还比较了使用 XF Flex 分析仪搭配 XF 3D 捕获微孔板-S 与 XFe24 分析仪搭配 XF24 胰岛捕获微孔板的检测性能。如图 10 所示，使用 XF Flex 分析仪搭配 XF 3D 捕获微孔板-S 时，细胞球的基础 OCR 大约是另一组的两倍，进一步证明了 XF Flex 系统的灵敏度优势。

图 10. 使用安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪搭配安捷伦 Seahorse 3D 捕获微孔板-S 和安捷伦 Seahorse XFe24 分析仪搭配安捷伦 Seahorse XF24 胰岛捕获微孔板，在不同数量的 HCT116-H2B-GFP 细胞球下测得的基础 OCR 的比较

化合物的最佳剂量取决于检测液组成（是否含 BSA 或 FBS）、细胞球的细胞类型、制备方式、细胞球大小及每孔数量。为确定 HCT116-H2B-GFP 细胞球的最佳 FCCP 浓度，我们在 0.25–2 µM 范围内进行了评估。图 11 表明，当每孔含有 20 个细胞球时，0.5–1.5 µM 的 FCCP 可获得相近且最高的最大 OCR。其中，1 µM 浓度下的数据重现性更好，故确定为最佳浓度。

图 11. 使用 HCT116-H2B-GFP 细胞球进行 FCCP 剂量优化。A. 以第 4 次测量的结果进行基线归一化获得的 OCR 百分比动力学曲线图。B. 加入 FCCP 后最大 OCR 百分比的柱状图（加入 FCCP 后的第一次测量）。来自一次代表性实验的数据

数据分析与归一化注意事项

可以使用基于云的软件应用程序安捷伦 Seahorse Analytics ，配合 3D 线粒体压力测试试剂盒，对 Seahorse XF 代谢检测数据进行分析。通过输入 XF 细胞线粒体压力测试试剂盒或 XF 3D 线粒体压力测试试剂盒产品标签上的 SW 代码，访问助手视图。3D 线粒体压力测试试剂盒助手视图提供了专为 3D 模型实验设计的小组件，支持对以下实验方案进行数据分析：在标准线粒体压力测试中，寡霉素不作为首次加药以及作为首次加药，或在急性加药实验中，寡霉素作为第二次加药。

Seahorse XF 检测数据的归一化对于实验结果的解读非常重要。它可以更大程度地减少因样本大小或数量差异而导致的孔间差异。最合适的归一化方法取决于实验使用的具体 3D 样本、研究目标及检测液等实验条件。针对使用 3D 样本生成的实验数据，可以考虑多种归一化方法，例如，使用基于成像的方法可以通过染色对象获取样本数量/大小、面积和荧光强度等信息。此外，也可以考虑相对于基础测量的信号变化百分比，或以总蛋白或 DNA 含量作为归一化依据。

基于成像的方法

在实验前后，可以采集明场图像，以确认样本在样本室中的位置。为了能够对胰岛或细胞球进行荧光成像，在最后一次的鱼藤酮/抗霉素 A 加样溶液中可以加入 Hoechst 染料。这种方法可以实现荧光成像，而不会受到筛网的干扰，而在明场图像中可能存在筛网干扰。使用 Gen5 软件，可以计算每个孔的总目标面积 (ObjectSumArea) 或总目标强度 (ObjectSumInt) 等定量指标（图 12）。

图 12. 实验前后，安捷伦 Seahorse XF 3D 捕获微孔板-S 中的胰岛。A. 实验前的明场图像。B. 实验后，经 Hoechst 33342 染色的荧光图像

如图 13 所示，当胰岛经 Hoechst 33342 核染料染色后，耗氧率 (OCR) 与总目标面积或总目标强度（荧光）之间呈现出更强的线性相关性。该数据对应于图 4A 中的数据，其中 OCR与胰岛数量呈正相关。此处，决定系数 (R²) 从 0.81 小幅提升至 0.88–0.91 范围。

图 13. OCR 与胰岛总目标面积 (A) 及 OCR 与胰岛总目标强度 (B) 之间的线性相关性

使用相同的数据，归一化后的 OCR 值如图 14 所示。在归一化之前，在含有 5–40 个胰岛的孔中，基础 OCR 的范围为 46–350 pmol/min。归一化后，在含有 10、20 和 40 个胰岛的孔中，基础归一化 OCR 的变化小于 15%，且每组内的变异系数 (%CV) 低于 20%。相比之下，仅含 5 个胰岛的孔表现出较高的变异性，表明该样本量不足以生成可靠的实验数据。

图 14. 按总目标面积对基础 OCR 进行归一化（使用图 4A 中的未归一化原始数据）

如图 15 所示，归一化前，胰岛线粒体压力测试的动力学曲线表现出较大的孔间变异性（CV 为 20%–36%）。当按总面积（图 15B）或总强度（图 15C）进行归一化后，数据变异性得到改善。按总目标面积进行数据归一化时，孔间变异性降低至 12%–14% CV；按总目标强度归一化时，CV 降至 5%–19%。

图 15. 使用安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪搭配安捷伦 Seahorse 3D 捕获微孔板-S，进行包含急性葡萄糖加药的安捷伦 Seahorse XF 线粒体压力测试获得的结果，每孔 20 个大鼠胰岛。A. 归一化前的 OCR 动力学曲线图。B. 按总目标面积进行归一化的 OCR 动力学曲线图。C. 按总目标强度进行归一化的 OCR 动力学曲线图

以基础信号进行归一化

基线归一化是另一种 Seahorse XF 检测数据归一化方法。该方法通过将信号转换为相对于基础测量值的百分比来实现，其中基础测量通常是指第一次加药之前的测量。当需要比较对急性处理或调节剂的响应时，可以使用此方法。这种方法尤其适用于异质性样本。在图 16 中，按第 4 次测量（即加入葡萄糖（或检测液）前的最后一次测量）的结果对图 15A 中的胰岛 OCR 数据进行了基线归一化，然后根据相对于基础信号的百分比来评估样本对葡萄糖的响应。结果表明，在对葡萄糖、寡霉素以及鱼藤酮/抗霉素 A 的响应中，基线归一化处理后数据的一致性有所提高。

图 16. 使用大鼠胰岛（20 个胰岛/孔）进行包含急性葡萄糖加药的安捷伦 Seahorse XF 线粒体压力测试。A. 按基础 OCR（第 4 次测量）进行归一化的 OCR 动力学曲线。B. 加入葡萄糖后的急性响应柱状图，以基础 OCR 进行归一化

其他归一化方法

除了本研究中评估的方法外，还有其他一些方法可供使用。这些方法包括在实验后对胰岛或细胞球进行处理（例如裂解并定量其中的蛋白质或 DNA 含量），以实现归一化。但是，这些方法可能会引入变异性，并且需要额外的处理时间。

胰岛主要产生并分泌胰岛素，许多处理方式都会影响胰岛素 RNA/蛋白质水平。因此，在胰岛实验中不建议使用总 RNA 或总蛋白质作为归一化指标，因为它们可能会受到胰岛素水平变化的影响。

结论

安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪搭配专用的安捷伦 Seahorse 3D 捕获微孔板-S，显著提高了灵敏度和检测效率，即使每孔只有 10 个胰岛，也能实现可靠的代谢分析。与旧款产品安捷伦 Seahorse XFe24 分析仪搭配安捷伦 Seahorse XF24 胰岛捕获微孔板（每孔需要 40–70 个胰岛）不同，全新的 XF Flex 系统非常适合稀缺或珍贵的胰岛样本，使研究人员能够在每次实验中设置更多实验条件和重复组。更高的灵敏度意味着，即使只有少量胰岛样本，也能更准确地检测出细微的代谢差异。此外，使用 HCT116-H2B-GFP 癌细胞球获得的实验数据表明，该系统同样适用于其他类型的小型 3D 材料。

无论您是研究胰岛生理学、筛选化合物，还是评估供体胰岛的活力，XF Flex 系统都能让您以更少的资源完成更多工作，同时不影响数据质量。

参考文献

1. Corbin, K.L.; West, H.L.; Brodsky, S.; Whitticar, N.B.; Koch, W.J.; Nunemaker, C.S. A Practical Guide to Rodent Islet Isolation and Assessment Revisited. Biol Proced Online. 2021, 23(1),7. DOI: 10.1186/s12575-021-00143-x

2. Li, D.; Kong, W.; Hong, Y.; Zhang, W.; Sun, B.; Wang, X.; Wang, K. Protocol for isolation and transplantation of rat pancreatic islets in the kidney capsule to treat diabetes. STAR Protoc. 2025, 6(1), 103486. DOI: 10.1016/ j.xpro.2024.103486

3. Liu, B.; Hua, D.; Shen, L.; Li, T.; Tao, Z.; Fu, C.; Tang, Z.; Yang, J.; Zhang, L.; Nie, A.; Jiang, Y.; Wang, J.; Li, Y.; Gu, Y.; Ning, G. NPC1 is required for postnatal islet β cell differentiation by maintaining mitochondria turnover. Theranostics. 2024, 14(5),2058-2074. DOI: 10.7150/thno.90946

本应用中使用的产品

安捷伦产品

安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪

安捷伦 Seahorse XF Flex 3D 捕获 FluxPak-S

安捷伦 Seahorse XF Flex 3D 捕获筛网插入工具

安捷伦 Seahorse XF Flex 3D 线粒体压力测试试剂盒

安捷伦 Seahorse XF Flex 细胞线粒体压力测试试剂盒

安捷伦 Seahorse XF DMEM 检测液包

安捷伦 BioTek Cytation 成像多功能微孔板检测系统

关于安捷伦细胞与基因组学

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