前沿 | 细胞能量分析与活细胞成像助力海洋天然产物诱导铜死亡的机制解析

2026-06-25 11:50:57 安捷伦细胞分析事业部（BioTek）

近年来，结直肠癌发病率和死亡率持续攀升，耐药问题尤为突出，导致现有治疗手段的临床获益相当有限。深入理解结直肠癌进展的分子机制、寻找新的治疗靶点，已经成为开发全新机制药物的关键突破口。海洋天然产物以其结构多样性和独特生物活性，长期以来一直是新药研发的重要源泉，尤其在抗癌领域展现出巨大潜力。

那么，当海洋天然产物遇上结直肠癌耐药细胞，能够带来意想不到的突破？

2025 年 9 月，来自海军军医大学、上海中医药大学与中国科学院上海药物研究所的研究团队在学术期刊 Journal of the American Chemical Society 在线发表题为“Marine Natural Product Chagosendine C Induces Cuproptosis in Colorectal Cancer Cells by Targeting FDX1”的研究论文，并被选为封面文章。该研究从海洋天然产物库中筛选出化合物 Chagosendine C（CHC），首次发现该铜配位二聚体生物碱能直接靶向 FDX1 蛋白，通过升高细胞内 Cu⁺ 浓度、诱导线粒体功能紊乱和活性氧爆发，特异性激活铜死亡通路，从而有效抑制结直肠癌细胞生长，并克服奥沙利铂耐药。该研究为开发靶向铜死亡的抗癌药物提供了全新先导化合物和理论基础。

海洋天然产物 CHC 抗结直肠癌的铜死亡机制

名词解释

铜死亡（cuproptosis）是一种近年来被阐明的、区别于细胞凋亡、坏死和铁死亡的新型程序性细胞死亡方式。其核心机制在于铜离子过量积累，导致脂酰化蛋白异常聚集和铁硫簇（Fe-S）蛋白丢失，最终引发线粒体功能崩溃和细胞死亡。铁氧还蛋白 1（FDX1）是铜死亡的关键上游调控因子，能够将低毒性的 Cu²⁺ 还原为高毒性的 Cu⁺。然而，能否利用天然产物靶向 FDX1 以激活铜死亡通路，用于克服耐药性肿瘤的治疗，目前尚缺乏系统性研究。

整体研究策略

从海洋天然产物库中筛选具有抗结直肠癌活性的化合物

通过抑制剂实验和金属离子替换实验明确细胞死亡方式及铜离子依赖性

利用 DARTS 蛋白质组学结合基因敲除技术，鉴定并验证直接作用靶点

采用细胞能量分析和活细胞成像技术，评估线粒体功能和铜离子动态

通过小鼠移植瘤模型验证体内抗肿瘤效果及安全性

研究结果

抗结直肠癌活性化合物的筛选与鉴定：海洋天然产物 Chagosendine C（CHC）

图 1. 220 种海洋天然产物在 RKO 细胞中的筛选结果，CHC 显示出最强的细胞活力抑制作用。

研究团队筛选了 220 种海洋天然产物来处理 RKO 结直肠癌细胞，CCK-8 细胞活力测定结果显示，化合物 CHC 在筛选体系中表现出最显著的细胞毒性。

随后研究团队通过安捷伦 BioTek Cytation 细胞成像多功能微孔板检测系统和流式细胞术，系统评估了 CHC 在体外对结直肠癌的细胞毒性。进一步剂量-反应分析表明，CHC 在 HCT116 和 RKO 细胞中的 IC50 分别为 0.79 μM 和 1.12 μM，并能诱导 G1 期细胞周期阻滞和细胞死亡。EdU 掺入实验证实，2.5 μM CHC 可显著抑制 HC116 和 RKO 细胞增殖活性。Calcein-AM/PI 活死细胞染色进一步显示，CHC 处理后，死细胞（红色）显著增多。此外，借助 Cytation 独特的彩色明场成像功能，对 CHC 处理后细胞集落形成能力进行了定量评估，结果进一步验证了其强效的体外抗肿瘤活性。

Cytation 细胞成像

多功能微孔板检测仪

图 2. (C)用 CHC 处理 HCT116 和 RKO 细胞，通过 EdU 实验检测细胞增殖能力（比例尺：200 μm），并进行定量分析。(D) 用 CHC 处理 HCT116 和 RKO 细胞，通过结晶紫染色检测克隆形成能力。 (G) 用 CHC 处理 HCT116 细胞，通过钙黄绿素- AM/PI 染色检测细胞死亡（比例尺：200 μm）。

CHC 诱导铜离子依赖性的细胞死亡

为明确 CHC 诱导的细胞死亡类型，研究团队分别加入凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）、坏死抑制剂（Nec-1）、铁死亡抑制剂（Lip-1、DFO），发现这些抑制剂均不能或仅能部分逆转 CHC的细胞毒性，提示 CHC 诱导了一种非经典的死亡方式。进一步实验发现，将 CHC 中的 Cu²⁺ 替换为 Ni²⁺、Co²⁺ 或 Zn²⁺后，所得类似物的细胞毒性显著下降；而使用铜离子螯合剂 TTM 则可完全逆转 CHC 的杀伤效应。这些结果表明，CHC 的细胞毒性严格依赖其所携带的铜离子。

图 3. 铜离子在 CHC 诱导的细胞死亡中作为核心效应因子发挥作用。（A）CHC 及其 Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺ 类似物对 RKO 细胞的毒性比较，含铜离子的 CHC 毒性最强。（E）铜离子螯合剂 TTM 完全逆转 CHC 诱导的细胞死亡。

Seahorse 细胞能量分析揭示 CHC 损害线粒体呼吸功能

由于铜死亡的核心事件发生在线粒体，研究团队采用安捷伦 Seahorse XFe96 能量代谢分析仪，检测 CHC 处理后结直肠癌细胞的氧气消耗率（OCR）。结果显示，与对照组相比，CHC 处理的 HCT116 和 RKO 细胞的基础呼吸和最大呼吸能力均呈剂量依赖性显著下降。该结果直接证明 CHC 严重损害了线粒体电子传递链功能，与铜死亡中线粒体代谢紊乱的特征完全一致。

Seahorse 细胞能量分析仪

图 4. 通过 Seahorse XFe96 分析仪检测 CHC 处理后的 HCT116 细胞耗氧率（OCR）。

Cytation 活细胞成像与靶点验证：CHC 直接结合 FDX1 并升高细胞内 Cu⁺ 浓度

为探究 CHC 的直接作用靶点，研究团队利用药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）技术联合蛋白质组学，筛选出 FDX1 为候选靶蛋白。通过 CRISPR/Cas9 敲除 FDX1 后，CHC 诱导的细胞死亡被显著逆转。Cytation 多功能微孔板检测系统被用于多个关键实验：

1	Calcein-AM/PI 活死细胞染色：
直观显示 CHC 处理后活细胞（绿色）减少、死细胞（红色）增加。
2	细胞内 Cu²⁺ 和 Cu⁺ 浓度检测：
CHC 处理后，细胞内毒性更强的 Cu⁺ 浓度显著升高，证实 CHC 通过 FDX1 促进 Cu²⁺ 向 Cu⁺ 的转化。
3	细胞集落形成实验：
定量评估 CHC 对细胞克隆形成能力的抑制。

进一步的细胞热移测定（CETSA）和微量热泳动（MST）实验证实，CHC 直接结合 FDX1 蛋白，关键结合位点为 Thr114。分子对接模拟显示 CHC 与 FDX1 的 Thr114 形成氢键相互作用。

CHC 体内抗肿瘤效果：有效抑制结直肠肿瘤生长且毒性较低

研究团队构建 Luc-HCT116 细胞皮下移植瘤 BALB/c 裸鼠模型，通过灌胃给予不同剂量 CHC（10、20、40 mg/kg），连续给药 12 天。结果显示，CHC 呈剂量依赖性地抑制肿瘤生长，40 mg/kg 组的肿瘤抑制率达 78.2%，肿瘤体积和重量均显著低于对照组。治疗期间小鼠体重无明显变化，提示 CHC 在有效剂量下未产生明显毒副作用。肿瘤组织免疫组化染色显示，CHC 处理后增殖标志物 Ki-67 和铁硫簇蛋白 LIAS 表达下降，而热休克蛋白 HSP70 表达升高，进一步证实肿瘤组织中发生了铜死亡。

结论与展望

研究团队通过海洋天然产物库筛选，发 CHC 具有显著的抗结直肠癌活性。通过抑制剂筛选、铜离子依赖性实验、Seahorse 能量代谢分析、Cytation 活细胞成像及靶点验证等技术，首次阐明 CHC 通过直接靶向 FDX1 蛋白、升高细胞内 Cu⁺ 浓度、诱导线粒体功能障碍和活性氧爆发，特异性激活铜死亡通路的全新机制。CHC 不仅能有效抑制结直肠癌细胞生长，还能克服奥沙利铂耐药，并在体内模型中表现出良好的安全性和药效。该研究为靶向铜死亡的抗癌药物开发提供了理想先导化合物，也为克服肿瘤耐药性提供了新策略。

在本研究中，安捷伦 Seahorse XFe96 能量代谢分析仪、Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测系统及其他分析平台，助力研究团队从线粒体功能、细胞活力、离子代谢和靶点结合等多个维度，交叉验证了 CHC 诱导铜死亡的完整机制，为海洋天然产物在肿瘤代谢领域的应用提供了新的技术范例和理论依据。

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