【干货回顾】肿瘤免疫直播没来得及看？ IHC/IF高频难题？我们一站式解答！

石蜡切片，想做免疫组化或是多重免疫荧光，切片目前在-20℃保存，拿出来的时候有什么注意事项？

尽量先把切片保持密封，让整盒/整板先回到室温后再开盖，这样可以减少温差带来的冷凝水；另外减少环境控湿：操作在 30–40% 湿度的无尘环境进行，避免高湿环境造成切片受潮。轻拿轻放，避免摩擦，尽快实验。

石蜡切片免疫组化染完DAB后组织上有脏点点怎么去除？

很难通过后处理去除。建议重做并在下一轮优化：使用新鲜二甲苯确保脱蜡彻底、DAB现配现用并过滤、合理降低抗体浓度并加强封闭，同时彻底清洁染色器具。

石蜡切片做的免疫荧光，用自发荧光淬灭剂能消除自发荧光吗？

商品化的淬灭剂可以在一定程度上将这类背景压下去，但不能保证完全淬灭所有信号。

关于免疫组化中免疫荧光是选石蜡切片好还是冰冻切片好？染色不均该如何考虑？

看重形态选石蜡，看重抗原真实性选冰冻。染色不均可能原因：脱蜡不充分、切片干涸、修复条件不合适、抗体浓度不当、洗涤不充分等。

成年小鼠心脏做石蜡切片时心脏标本固定、脱水、浸蜡的时间是多久？

建议4% PFA 4℃固定24–48h；梯度酒精各30-60min；二甲苯透明2次各20-30min；60℃石蜡浸蜡2-3次各30-60min。心脏致密，需保证固定充分、脱水彻底。

对于磷酸化蛋白、膜蛋白，是否冰冻切片更好？用石蜡切片需注意什么？

冰冻切片更有优势。如必须用石蜡切片，注意：新鲜4% PFA短时间固定（<24h），脱水时间不宜过长，优先选择EDTA（pH 8-9）温和修复。

抗原修复后，切片应在修复液里自然冷却，还是冲冷水？

必须自然冷却！切勿冷水冲淋。自然冷却有助于抗原表位复性，骤冷会导致组织碎裂、信号丢失和背景增高。

做人组织石蜡切片上RYR2与FKBP12.6复合物的表达，一抗二抗有什么推荐？

推荐不同宿主的一抗 + 对应物种特异、cross-adsorbed二抗。多重IF常规做法即“不同宿主一抗+species-specific二抗”。可联系赛默飞技术支持（4008208982-2-5）。

IHC中标记抗体的染色剂选用有哪些要点？

首选HRP-DAB体系（灵敏度高、背景低）；组织有内源性过氧化物酶干扰可选AP体系或红色显色剂。多重染色选择颜色对比明显的组合。

肺癌小鼠转移模型，用什么指标确定转移细胞是肺癌细胞？Ki67可以吗？

Ki67是增殖标志物，不能证明来源。肺癌没有黄金标准的特异性maker，需根据肺癌类型参考文献选择合适的maker。

免疫组化过程中，DAB显色后发现切片着色不均匀？

可能原因：脱蜡不充分、染色过程中干涸、抗原修复条件不合适、抗体浓度不合适、洗涤不充分等。若信号分布与组织结构对应，也可能是真实信号。

免疫组化抗原阳性检测率及着色很弱，什么原因？

通常与抗原暴露不足（修复条件不合适）、抗体浓度偏低/效价低、检测体系灵敏度不够有关。建议优先优化修复条件，其次调整抗体浓度。

IHC实验中，酸染色和碱染色应该如何选择？

常规组织优先选酸性修复（柠檬酸盐 pH6.0），背景低；核抗原或跨膜蛋白选碱性修复（EDTA pH8.0-9.0），显色强。复染苏木素为弱碱性，显色终止以中性或弱酸性为佳。

苏木素复染多久合适？染深了怎么退？

一般30s-2min。染深了可用分化液快速分化几秒，镜下观察，达到理想程度后及时返蓝。

你们这个技术到底能同时做多少重？是固定光谱通道吗？

一般可做到8-plex + DAPI。颜色可灵活组合，6-8个指标可在同一流程完成，前提是每个抗体需先做单标优化。

多重免疫荧光出现通道串色，如何降低？

选择光谱分离度高的荧光染料，合理设置通道或采用光谱拆分；降低一抗/二抗浓度，延长封闭时间；同时用未染对照评估自发荧光。

与传统多色IF相比，Aluora技术的核心优势到底是“重数更多”，还是“信号更干净、定量更准”？

核心优势不仅是“重数更多”。Aluora是类似TSA的信号放大体系，能带来信噪比的显著提高，结合S1000的光谱拆分能力，实现信号更干净、定量更准。

这个技术能和小鼠器官透明化成像（如CUBIC）结合吗？

S1000仪器主要目的是用于组织切片样本的多重靶标检测，目前还没有测试过对较厚组织透明化的兼容性，不确定其后续是否会在适配的样本上进行调整。

做完WB的一抗回收后可以用来做IHC吗？

一般不建议。WB回收的一抗已被消耗、污染且效价下降。若样本珍贵想尝试，需离心过滤并做预实验，但常规实验推荐使用新鲜一抗。

同一抗体在IHC（DAB）成功，转到IF（共定位）为什么失败？

若组织类型不变，通常不是修复问题。无信号/信号弱时，可能是荧光灵敏度不如DAB，可增加二抗浓度或使用TSA放大系统；有非特异性信号时，做“只染二抗”对照排除。

一抗4℃过夜孵育好，还是室温2小时？过夜会增加非特异性吗？

均可。表达量低或易有非特异性时，4℃过夜更稳；高表达高亲和力抗体室温1-2h足够。过夜本身不增加非特异性，真正导致背景高的是浓度过高或封闭不足。

一抗用PBS稀释还是专用抗体稀释液？加吐温或BSA影响大吗？

优先用专用抗体稀释液，已平衡pH和蛋白保护成分。加BSA降背景，加吐温（Tween-20）帮助洗涤，但过量可能压低弱信号。

背景着色太深，先延长封闭时间还是先降低一抗浓度？

优先降低一抗浓度（最常见原因）。在此基础上再适当延长封闭时间，达到信号清晰、背景干净的平衡。

封闭时，用正常血清和用BSA封闭的主要区别？可以混用吗？

血清含免疫球蛋白（IgG），可阻断Fc受体，样本涉及免疫细胞时优先选血清；其他情况BSA封闭足够。可以混用。