4步搞定！国自然热点外泌体：从提取到数据分析，保姆级研究方法分享！

2026-04-29 15:45:12 江苏三黍生物科技有限公司

外泌体研究从被误认为是“细胞垃圾”，到成为生命科学领域的研究热点，历经数十年发展，可按发现认知、功能揭示、爆发增长、临床转化四个阶段梳理关键进展：

发现与命名阶段（1979-1987年）：1979-1981年，Trams等首次发现细胞外存在具有酶活性的囊泡，是外泌体的最初描述；1983年，Pan和Johnstone从网织红细胞培养液中发现膜性小囊泡；1987年，Johnstone将其正式命名为“外泌体（exosome）”，此时外泌体被认为是细胞清除废物的途径。
功能初步揭示阶段（20世纪90年代）：1996年，Graça Raposo团队发现B淋巴细胞分泌的外泌体可携带MHC II类分子激活T细胞免疫反应，首次证实其在细胞间通讯和免疫调节中的作用；1998年，研究发现树突状细胞分泌的外泌体能诱导抗肿瘤免疫反应，进一步拓展了外泌体的功能认知。
研究爆发阶段（2007年至今）：2007年，Jan Lötvall团队发现外泌体携带mRNA和miRNA且能在靶细胞中翻译表达，证明其可传递遗传信息，掀起外泌体研究热潮；2013年，细胞囊泡运输调控机制研究获诺贝尔生理学或医学奖，极大提升了外泌体领域的关注度。此后，研究发现外泌体参与肿瘤、神经退行性疾病等多种疾病的发生发展，其携带的生物分子也被广泛鉴定。
临床转化探索阶段（近年）：外泌体在液体活检、药物递送、再生医学等领域的应用被广泛探索，如间充质干细胞来源的外泌体喷鼻治疗阿尔茨海默病进入临床试验，植物来源外泌体、工程化外泌体的研究也逐步推进。

外泌体的提取纯化、系统表征与组学深度解析是揭示其生物学功能与临床应用价值的核心环节，三者层层递进，需兼顾技术标准化与研究针对性。

以下为适配基础科研与转化研究的完整实施思路：

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外泌体高效提取

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提取方法选择：基础研究优先用差速离心法（反复离心去除细胞碎片、凋亡小体），搭配蔗糖密度梯度离心进一步纯化；临床少量样本可选试剂盒法（基于聚合物沉淀或免疫亲和捕获，如CD63抗体磁珠法），兼顾效率与纯度；高纯度需求场景可采用超速离心联合超滤法，去除蛋白杂污染。

图1. 血浆外泌体提取方法

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外泌体系统表征

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透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）：观察典型杯状形态，确认外泌体结构完整性。

图2. 外泌体透射电镜图

纳米流式细胞术/纳米颗粒追踪分析（NTA）：精准测定颗粒粒径（30-150nm为合格范围）、浓度及分布均匀性。

图3. 纳米流式细胞术测定外泌体粒径及浓度

标志物验证：Western blot 检测标志性蛋白，阳性指标选CD9、CD63、CD81、TSG101，阴性指标选Calnexin（排除内质网污染）；流式细胞术分析表面标志物表达谱，明确外泌体来源细胞类型（如肿瘤细胞来源外泌体检测EpCAM）。

图4. WB检测外泌体标志蛋白

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多组学技术挖掘外泌体分子功能特征

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蛋白质组学：采用定量蛋白组学鉴定差异蛋白，结合磷酸化蛋白组学分析关键信号通路蛋白修饰状态，揭示外泌体蛋白介导的细胞通讯机制。

广州中医药大学第二附属医院、北京蛋白质组研究中心等团队在《Journal of Ethnopharmacology》发表题为：Serum-derived exosome proteomics unveils the distinct and adjustable nature of the dampness constitution in traditional Chinese medicine的研究文章，该研究通过血清外泌体蛋白质组学技术，明确了中医痰湿体质（DC）与平和体质（BC）的分子差异，证实茯苓泽泻汤（FLZXD）可调节痰湿体质异常。研究发现，痰湿体质者外泌体中存在165个差异表达蛋白，富集于补体凝血级联、胆固醇代谢等通路，且 FLZXD 可通过调控这些通路改善痰湿相关高血脂，鉴定出 APOB、CFHR1 等4个潜在标志物，为痰湿体质的客观辨识和治疗提供了依据。本研究将蛋白质组学分析、网络药理学分析和临床验证相结合的综合方法为中药体质研究建立了一种综合方法。这种方法提供了（1）对DC分化的分子见解，（2）基于机制的靶向治疗策略的基础，以及（3）增强患者分层以支持个性化治疗方法。

图5. 血清外泌体蛋白质探究痰湿标志物

核酸组学：通过small RNA测序解析miRNA、piRNA等非编码RNA表达谱；针对特异性研究需求，可补充lncRNA测序或circRNA测序，同时结合qPCR验证核心核酸分子的表达水平。

武汉大学中南医院的团队在《Molecular and Clinical Oncology》发表了题为：Advances in exosomal noncoding RNAs in cervical cancer (Review)的综述文章：本综述强调了外泌体ncRNAs在宫颈癌（CC）发病机制中的关键作用，包括肿瘤的发生、进展、转移、血管生成和耐药性，并讨论了它们作为CC诊断、治疗靶点和预后工具的新生物标志物的潜力。然而，这些ncRNAs的长期安全性和有效性需要临床试验的进一步证实，这在外泌体广泛应用于CC之前是至关重要的。尽管外泌体在CC的诊断、治疗和预后方面具有巨大潜力，但在将其转化为治疗用途之前仍有几个挑战需要解决，包括外泌体分离和储存方案的标准化、药物装载效率的优化、对货物释放动力学的精确控制以及广泛临床试验的完成。

图6. 子宫颈癌症外泌体非编码RNA综述

代谢组学与脂质组学：利用LC-MS/MS技术检测外泌体中脂质（如磷脂、胆固醇）、氨基酸、代谢小分子等；脂质组学可单独采用脂质组专用质谱分析，适配外泌体富含脂质的特性，尤其适用于心血管疾病、肿瘤代谢研究。

南方医科大学团队在《Bioact Mater》上发表题：Lipidomic analysis of plant-derived extracellular vesicles for guidance of potential anti-cancer therapy的研究文章。植物来源的细胞外囊泡（PEV）被认为是纳米药物和药物递送系统的优越来源。然而，由于在生物医学应用中缺乏清晰度甚至存在矛盾，它们的临床翻译受到了阻碍。在此，作者对四种常用的PEV（葡萄柚、生姜、柠檬、葡萄）进行了全面的成分分析，以充分了解其功能性脂质含量并评估其潜在的治疗应用。脂质组学分析显示，生姜衍生EV（GEVs）中存在细胞毒性的gingerols and shogaols。随后的体外和体内研究证实了GEV显著的肿瘤细胞抑制和肿瘤生长抑制功效。转录组学分析表明，GEVs调节细胞周期和p53信号通路，从而诱导癌症细胞凋亡。补充蛋白质组学分析表明了PEV研究中潜在的蛋白质标记。这些发现强调了多组学分析在阐明PEV的潜在治疗作用和推进基于PEV的疗法发展方面的价值。

图7. 植物外泌体多组学分析阐明其潜在功效

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数据整合与功能验证

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借助GO/KEGG富集分析、STRING蛋白互作网络等工具，整合多组学数据筛选核心差异分子（如关键蛋白、特异性miRNA）。后续通过体外细胞实验（如外泌体干预受体细胞，检测增殖、迁移表型）和体内动物模型（如尾静脉注射荧光标记外泌体，追踪分布及病理影响）验证核心分子功能，明确外泌体的调控作用机制。

综上所述，想要在外泌体领域深耕，多组学还是比较推荐的思路方案~

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参考文献：

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2. Wu W, Wang C, Zhang T, Chen X, Zhou H, Tan F, Yuan J, Chang L, Sun C, Sun Y, Guo J, Wang G, Zhang Y, Xu P, Yang Z. Serum-derived exosome proteomics unveils the distinct and adjustable nature of the dampness constitution in traditional Chinese medicine. J Ethnopharmacol. 2025 Sep 25;353(Pt B):120353. doi: 10.1016/j.jep.2025.120353. Epub 2025 Aug 8. PMID: 40784529.

3. Xie X, Guan H, Li M, Gao W, Wu K. Advances in exosomal non-coding RNAs in cervical cancer (Review). Mol Clin Oncol. 2025 Oct 3;23(6):104. doi: 10.3892/mco.2025.2899. PMID: 41158703; PMCID: PMC12555848.

4. Wang F, Li L, Deng J, Ai J, Mo S, Ding D, Xiao Y, Hu S, Zhu D, Li Q, Zeng Y, Chen Z, Cheng K, Li Z. Lipidomic analysis of plant-derived extracellular vesicles for guidance of potential anti-cancer therapy. Bioact Mater. 2024 Dec 10;46:82-96. doi: 10.1016/j.bioactmat.2024.12.001. PMID: 39737211; PMCID: PMC11683192.