澳科大IF 8.3/Q1中药研究策略：网药+多组学，“成分-靶点”网络解析黄芩厚朴汤抗肿瘤机制

黄芩厚朴汤（HQHPD）治疗结直肠癌有显著疗效；然而，其具体的药理学靶点和分子机制在很大程度上仍不清楚。中药配方的复杂性对传统方法提出了严峻的挑战，这些方法侧重于分离主要活性成分以阐明治疗机制，因为这些方法往往忽视了这些成分之间的协同作用。

HQHPD、正常及肿瘤组织、粪便

中药入血成分分析、网络药理学、分子对接、转录组学、16S等

在作者之前的研究中确定了HQHPD的血液吸收成分（Gao等人，2025）。在汤剂和血清样本中鉴定出原型化合物，包括黄酮类化合物、氨基酸及其衍生物、生物碱、酚酸、木脂素、香豆素、萜类化合物、核苷酸及其衍生物、有机酸、脂质和其他类别的化合物。图1显示了所有HQHPD提取物的HPLC衍生化学特征（Gao等人，2025）。使用这些成分，通过Swiss Target Prediction、SuperPred、HERB和CTD数据库确定了HQHPD的抗癌靶点，产生了2642个靶基因。

图1. HQHPD化学成分鉴定

在正常和肿瘤组织中总共鉴定出1632个与HQHDP相关的差异表达mRNA（FDR<0.001）。随后的单变量Cox比例风险回归分析显示，120个HQHDP相关mRNA与总生存期（OS）显著相关（图2A）。

接下来，426名符合条件的结肠癌（COAD）患者被随机分为训练组（n=213，50%）和测试组（n=213，50%）。表1总结了两组的临床特征。使用LASSO Cox回归分析构建了一个包含20个HQHPD相关mRNA的风险预测模型，在λ值为0.0503时实现了最佳特征选择，对应于最小偏似然偏差（图2B-C）。

最后，多变量Cox回归分析确定了11种关键的HQHPD-mRNA（GDF15、PTH1R、CXXC5、DDIT3、FDFT1、DRD4、CLK1、S1PR5、ULK3、HDC和INHBB）作为风险特征（图2D）。其中，7种mRNAs表现出正系数（危险因素），4种表现出负系数（保护因素），表明HQHDP的靶点既是致癌途径，也是肿瘤抑制途径。

图2. 结肠癌（COAD）患者HQHPD mRNA预后特征的发展

通过结合回归系数和11种关键HQHPD mRNA的表达水平，建立了COAD的HQHPD mRNA风险特征。在训练队列中，根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier生存分析显示，与低风险组相比，高风险组的总体生存率明显较差（图3A）。在验证队列和整个TCGA数据集中也观察到了类似的结果（图3B和C）。

时间依赖性ROC分析显示，在训练集中（图3D），1年、3年和5年生存期的风险特征AUC值分别为0.794、0.802和0.841，C指数为0.792；在验证集中（图3E），1年、3年和5年生存期的AUC值分别为0.686、0.702和0.674，C指数为0.672；在合并数据集中（图3F），1年、3年和5年生存期的AUC值分别为0.745、0.748和0.758，C指数为0.735。这些结果表明了风险特征的稳健预测能力。

Kaplan-Meier和时间ROC分析（图3G-H）在独立的GSE39582队列中得出了类似的结果。全TCGA数据集中的临床病理相关性分析显示，风险组之间的生存状态和肿瘤分期存在显著差异，如条形图所示（图3I）。

图3. 四组COAD患者HQHPD mRNA风险特征的预后评估和验证

DEGs分析确定了TCGA队列中两组之间90个下调基因和135个上调基因，其中前10个DEGs显示在火山图中（图4A）。GSEA旨在探索高风险和低风险亚组之间的生物过程和途径差异，并描述与风险评分相关的途径。高危组的ECM受体相互作用、局灶性粘连、神经活性配体受体相互作用和癌症相关途径显著富集，而系统性红斑狼疮途径在低风险组中富集（图4B），表明高危途径是致癌因素。还使用ESTIMATE算法分析了免疫和基质成分的分布。高危组的免疫评分低于低危组（图4C）。应用CIBERSORT算法评估免疫浸润差异，并研究HQHPD mRNA特征与肿瘤浸润免疫细胞之间的关联。与低风险组相比，高风险组表现出浆细胞、静息/记忆CD4+T细胞、静止/活化树突状细胞和嗜酸性粒细胞的浸润减少，但Tregs和M0巨噬细胞的浸润增加（图4D）。比较分析还显示，高危人群的免疫功能受到抑制（图4E）。从敏感人群的预测模型来看，高危人群中致癌途径的激活和免疫抑制状态可能代表了HQHDP调节预后的关键机制。

图4. 两组之间的DEGs分析

肿瘤微环境中的炎性细胞因子调节血管生成，驱动肿瘤生长和转移，并促进对癌症疗法的抵抗，这是公认的。值得注意的是，Tregs通过调节免疫细胞活性来抑制免疫系统靶向肿瘤细胞的能力。本研究结果表明，HQHPD-mRNA风险评分降低与通过调节免疫微环境延迟肿瘤进展有关。此外，HQHPD显示出调节HQHPD-mRNA风险评分的潜力。首先在CRC小鼠模型中评估了HQHPD治疗的效果，HQHDP显著降低了肿瘤负担（图5A-B）。随后，通过流式细胞术从血液和脾脏组织中分离免疫细胞，研究了CRC小鼠模型中的炎症反应。结果显示，HQHPD治疗后，血液（图5C）和脾脏样本（图5D）中CD4+、FOXP3+和CD25+Tregs的数量显著减少。这些发现表明，HQHPD的抗肿瘤作用是通过抑制Tregs介导的。

图5. HQHDP的抗肿瘤作用是由Tregs介导的

首先，从GeneCards和TCMIP数据库中检索到3142个腹泻相关靶点和5515个骨髓抑制相关靶点。随后，通过Swiss Target Prediction、SuperPred和CTD数据库获取5-FU和伊立替康靶点，得到757个伊立替康靶点和1487个5-FU靶点。使用维恩图分析，我们确定了5-FU诱导腹泻（图6A）、伊立替康诱导腹泻（见图6B）和5-FU诱导骨髓抑制（见图6C）的潜在靶点，分别获得448、278和690个靶标。

使用STRING数据库构建了三个不良事件类别的PPI网络。下载TSV格式的PPI数据后，使用Cytoscape分析拓扑特征，根据度和介数中心性对节点进行排序。按程度排列的前50个目标如图6A-C所示。值得注意的是，PPI网络分析揭示了5-FU诱导的腹泻、伊立替康诱导的腹泻和5-FU引发的骨髓抑制之间的重叠目标。TP53、EGFR、SRC和AKT1是核心共享靶点，表明这些基因可能导致多种化疗诱导的毒性。

图6. 5-FU诱导腹泻（A）、伊立替康诱导腹泻（B）和5-FU诱导骨髓抑制（C）潜在靶点的Ven图和PPI网络分析

与5-FU-诱导的腹泻、5-FU诱导的骨髓抑制和伊立替康诱导的腹泻相关的靶基因进行GO和KEGG通路分析。该分析确定了每类不良事件的前10个BP、CC和MF。关于5-FU诱导的腹泻（图7A），BP主要与对外源性刺激的反应、腺体发育和对氧化应激的反应有关；CC主要与膜筏、膜微区和局灶性粘连有关；MF主要与DNA结合、转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合和RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合有关。对于5-FU诱导的骨髓抑制（图7B），BP主要与腺体发育反应、外源性刺激反应和氧气水平反应有关；CC主要与局灶性粘连、细胞-基质连接和膜筏有关；MF主要与DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因素结合和泛素样蛋白连接酶结合有关。对于伊立替康诱导的腹泻（图7C），BP主要与对外源性刺激的反应、细胞对肽的反应和对肽激素的反应有关；CC主要与膜筏、膜微区和质膜外侧有关；MF主要与蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸激酶活性和蛋白酪氨酸激酶活性有关。

图7D-F所示的气泡图分别描绘了5-FU诱导的腹泻、5-FU-诱导的骨髓抑制和伊立替康诱导的腹泻中富集率最高的前20条KEGG通路。KEGG通路分析显示，5-FU诱导和伊立替康诱导的腹泻主要与PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡和病毒感染通路有关。相比之下，5-FU诱导的骨髓抑制主要与PI3K-Akt信号通路、凋亡和细胞周期通路有关。

图7. GO和KEGG分析

选择核心靶点（按程度值排名的前5个基因）进行分子对接，产生10个药物靶点对，包括5-FU-TP53、伊立替康-TP53、5-FU-AKT1、伊立他康-AKT1，5-FU-SRC、伊立特康SRC、5-FU-EGFR、伊立异康EGFR、5-FU-STAT3和5-FU-EP300。结合能≤-5 kcal/mol（表2），表明5-FU/伊立替康与这些靶标之间存在稳定的相互作用。这些发现表明，5-FU可能会引起腹泻和骨髓抑制，而伊立替康可能会通过与这些核心靶点结合而引起腹泻。这种多药理学特征表明，疾病的发病机制是由几个分子途径的协调功能障碍引起的，而不是单个基因的异常。然而，需要额外的实验研究来证实这些结果。

如前所述，确定了2642个HQHPD靶标，以及448个与5-FU-诱导的腹泻相关的靶标，278个与伊立替康诱导的腹泻有关的靶标，以及690个与5-FU-诱导的骨髓抑制有关的靶标。通过维恩图分析，确定了HQHPD与这些不良事件相关靶点的重叠靶点。因此，确定了248个与5-FU诱导的腹泻相关的潜在治疗靶点，320个与5-FU-诱导的骨髓抑制相关的靶点，191个与伊立替康诱导的腹泻有关的靶点（图8A-C）。这些发现表明，HQHPD通过多成分靶向策略保护了化疗引起的毒性，涉及不同毒性途径的几个关键节点。

使用STRING数据库构建了与5-FU-诱导的腹泻、5-FU-诱导的骨髓抑制和伊立替康诱导的腹泻相关的HQHPD靶点的PPI网络（图S2A-C）。在检索TSV格式的PPI数据后，使用Cytoscape进行拓扑分析，根据度和介数中心性对节点进行优先级排序。进一步可视化了按程度排名的前50个目标（图8D-F）。值得注意的是，包括TP53、AKT1、SRC、STAT3和EGFR在内的重叠核心靶点在所有三个网络中都是共享的，这表明这些基因介导了HQHPD对多种化疗诱导的毒性的保护作用。

图8. HQHDP和5-FU诱导或伊立替康诱导的不良事件的常见靶点

基于中药化合物的多组分和多靶点特征，构建了HQHPD组分靶网络。根据5-FU诱导腹泻（图9A）、5-FU诱导骨髓抑制（图9B）和伊立替康诱导的腹泻（图9C）的靶点分析的程度值，选择了前5个HQHPD特异性成分（表S1）。对与HQHDP成分和5-FU/伊立替康诱导的不良事件相关的核心靶点进行分子对接，生成药物靶点结合数据集。≤-5 kcal/mol的结合能（表3）表明HQHPD成分或化疗药物与其分子靶标之间存在强烈的相互作用，相应的pKi值如表3所示。分析表明，不同化疗药物引起的毒性和副作用在关键靶点上表现出相似性。例如，TP53、AKT1和SRC是参与化疗诱导的毒性和副作用的关键基因。具体来说，TP53与汉黄芩素（-7.5 kcal/mol）、厚朴酚（-7.2 kcal/mol）；AKT1与汉黄芩素（-7.9 kcal/mol）、厚朴酚（-7 kcal/mol）；SRC与汉黄芩素（-8.5 kcal/mol）、厚朴酚（-7.8 kcal/mol）。这表明，单一天然化合物有可能缓解多种毒性和副作用，突出了中药配方的广谱功效。此外，这些发现表明，HQHDP的成分可以通过与这些特定靶点结合来减轻化疗引起的毒性。然而，还需要进一步的实验验证。

图9.HQHDP化合物和5-FU诱导或伊立替康诱导的不良事件的共同靶点

为了评估肠道微生物群落的丰富度、均匀度和多样性，计算了Chao1和Shannon指数。在HMB（Honokiol-Magnolol-Baicalin）治疗组中，与对照组相比，这两个指标都有所升高，但差异没有统计学意义（图10A-B）。这些发现表明，HMB治疗不会破坏肠道微生物群平衡。每个样本中细菌属和种的相对丰度如图10C-D所示。为了探索HMB组和对照组之间微生物群组成的差异，选择了相对丰度大于1%的微生物在属和种水平上进行比较（图10E-F）。在HQHPD组中，几个属的丰度增加了，包括Lachnospiraceae_NK4A136、梭菌科、Ruminococcus、Lachnospiriceae、Paramuribaculum、厚壁菌门、Ruminoccoccacae、梭菌属、UCG-005、真杆菌属、艾森伯格菌属、示波孢菌科、异丙菌属、振荡杆菌属、单球菌属、脱硫弧菌科、厌氧菌属、幽门螺杆菌属、Incertae Sedis、异杆菌属、肠单胞菌属、Lachnopsiraceae_UCG-006和乙酰化因子。相反，与对照组相比，HQHPD组中杜博氏菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、泛球菌、梭菌科、沙门氏菌、Shewanella和细小杆菌等属的丰度显著降低。值得注意的是，在由HQHPD核心成分调节的微生物类群中，有几个与腹泻有关。这些结果表明，HQHPD调节肠道微生物群组成，促进有益细菌的生长并抑制有害细菌，从而有助于改善化疗引起的腹泻。

图10. 从HQHDP中提取的活性成分对肠道微生物群调节的影响

在这项研究中，11个关键的预后基因（GDF15、PTH1R、CXXC5、DDIT3、FDFT1、DRD4、CLK1、S1PR5、ULK3、HDC和INHBB）被确定为CRC患者HQHDP的靶基因。该研究系统地探索了HQHDP的潜在抗肿瘤机制，并采用网络药理学和毒理学相结合的方法阐明了HQHPD如何减轻化疗引起的毒性。这些发现不仅为中药复方的精准治疗提供了新的见解，而且为理解中药复方疗法减轻化疗毒性的机制奠定了坚实的科学基础。