H.E.L 生物燃料的合成—BioXplorer 生物反应器

生物燃料的合成研究是指通过化学、生物和工程等多学科手段，将生物质（如植物、微生物、废弃物等）转化为可替代传统化石燃料的能源产品。这些能源产品包括生物柴油、生物乙醇、生物航空燃料、生物氢等，旨在开发可持续、环保的能源解决方案。

随着全球人口增长和经济快速发展，对能源的需求不断增加。传统化石燃料（如石油、煤炭、天然气）储量有限且不可再生，其开采和使用导致严重的环境污染和温室气体排放。生物燃料作为一种可再生资源，具有可持续性，能够在一定程度上缓解能源短缺问题。生物燃料在生产过程中吸收二氧化碳，在使用过程中释放的二氧化碳与生产过程中吸收的二氧化碳基本平衡，从而实现碳中和。

此外，生物燃料的生产可以利用农业废弃物、林业残留物等，减少这些废弃物对环境的污染。

目前，生物质转化为生物燃料的效率仍然较低，需要进一步优化催化技术和工艺流程，提高转化效率。生物燃料的生产成本较高，特别是与传统化石燃料相比。降低生产成本是实现大规模商业化应用的关键。随着科技的不断进步，新的催化技术、生物技术和工程方法将不断涌现，有望大幅提高生物燃料的生产效率和降低成本。

案例：在加压生物反应器中利用二氧化碳培养杀虫贪铜菌Cupriavidus necator生产异丙醇

Garrigues, L., Maignien, L., Lombard, E., Singh, J., & Guillouet, S. E. (2020). Isopropanol production from carbon dioxide in Cupriavidus necator in a pressurized bioreactor. New Biotechnology, 56, 16–20. 

背景: 随着对可持续化学合成的需求不断增加，利用二氧化碳（CO₂）作为碳源进行生物燃料和化学品生产的微生物过程受到越来越多的关注。Cupriavidus necator（C.necator）因其高效的CO₂利用能力和快速生长特性而备受关注。这种微生物能够将CO₂转化为多种化学品，如聚(3-羟基丁酸)（P(3HB)），并且其代谢途径中的乙酰辅酶A（acetyl-CoA）是许多重要化学品的前体，这使得通过₂基生物过程的工业化具有重要意义。

研究方法：一种新型高压生物反应器的设计及其在利用二氧化碳（CO₂）生产异丙醇（isopropanol）方面的应用。研究团队通过优化生物反应器的设计，实现了从CO₂到异丙醇的高效生物转化，并展示了其在实验室规模上的潜力。

生物反应器设计

·独立气体输入：生物反应器设计了三个独立的气体输入通道（CO₂、H₂和空气），以优化气体组成并提高气体在培养液中的溶解度。

·高压操作：通过在高压下运行生物反应器，显著提高了气体传质效率，从而实现了更高的细胞密度和产物浓度。

·安全系统：为了避免气体混合物达到爆炸性浓度，生物反应器配备了氧气浓度控制系统，当氧气浓度超过安全阈值时，会自动用氮气冲洗反应器头部空间。

实验方法

·菌株选择：使用了C.necator Re2133作为参考菌株，以及一个经过基因工程改造的异丙醇生产菌株Re2133/pEG7b。

·培养基和种子培养：使用了两种培养基，一种用于种子培养，另一种用于生物反应器中的培养。种子培养在摇瓶中进行，然后转移到生物反应器中。

·培养条件：在500mL的Xplorer®生物反应器中进行培养，工作体积为330mL。通过调节搅拌速度和气体流量来控制溶解氧水平，同时保持温度在30℃，pH值在7.0。

实验结果：

·高压对生长的影响：在高压（最高达4bar）条件下，C.necator Re2133的生长未受到负面影响，细胞活性保持在95%以上。

·独立气体输入的优势：通过独立控制气体输入，实现了更高的细胞密度和生长速率。在优化的气体组成下，细胞生长速率可达0.11±0.01h⁻¹。

·异丙醇生产：使用改造菌株Re2133/pEG7b，在生物反应器中实现了3.5g/L的异丙醇生产，这是首次在实验室规模上通过工程菌实现从CO₂到异丙醇的高效转化。

结论：

·生物反应器设计的成功：通过独立气体输入和高压操作，显著提高了气体传质效率，从而实现了更高的细胞密度和异丙醇产量。

·CO₂作为碳源的潜力：研究证明了从CO₂生产异丙醇的可行性，并展示了CO₂作为可持续碳源在生物合成中的巨大潜力。

·未来发展方向：这项研究为开发基于CO₂的商业化生物过程提供了重要的技术基础，并为未来利用微生物进行可持续化学品生产的进一步研究奠定了基础。

生物合成培养：

生物反应器配置：

·使用500mL总容量的BioXplorer生物反应器（HEL Ltd, UK），工作液体体积为330mL。

·生物反应器配备了pH、溶解氧（DO）、温度和压力控制器，并通过Xplorer®软件进行在线监控和控制。

·气体输入通过三个独立的气体输入通道（CO₂、H₂和空气）以及一个用于纯氮气的安全系统，每个气体输入通道都由气体质量流量计控制。

·氧气浓度通过Tandem Pro气体分析仪（Magellan BioTech HEL Ltd, UK）进行分析，以确保安全。

培养条件：

·温度维持在30℃，pH值维持在7.0，通过添加14%（v/v）的NH₄OH进行调节。

·溶解氧水平通过调节搅拌速度和/或进气流量控制在空气饱和度的5%以下，以限制C.necator氢化酶的溶解氧抑制作用。

种子培养：

·使用C.necator Re2133作为参考菌株，以及改造的异丙醇生产菌株Re2133/pEG7b。

·种子培养在TSB琼脂平板上进行，30℃下培养36小时，然后在含有抗生素的TSB培养基中培养24小时。

·接种到250mL的矿物培养基A中，30℃、100rpm下培养18小时。

·细胞通过离心收集，去除残余的葡萄糖后，用新鲜的矿物培养基B重悬，接种到生物反应器中。

生物反应器运行步骤：

·使用商业气体混合物（H₂/O₂/CO₂/N₂，摩尔比为60:2:10:28）进行初步实验，随后改为独立气体输入。

·通过独立气体输入实现H₂、O₂和CO₂的优化比例，例如88%H₂、2%O₂和2.5%CO₂。

·在大气压下运行15小时后，通过逐步增加反应器压力（最高达4.2bar）来维持溶解氧水平。

·在异丙醇生产实验中，使用改造菌株Re2133/pEG7b，气体输入比例为87%H₂、2%O₂和3%CO₂。

·通过调节气体流量和压力，维持溶解氧水平在2%饱和度，同时避免氧气浓度超过爆炸性范围。

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