CTech SoloVPE：基于可变光程技术的高效ADC DAR与蛋白浓度分析平台

目前测量DAR的主要技术包括：疏水作用色谱（HIC）、反相色谱（RP）、质谱（MS）和紫外-可见分光光度法（UV/Vis）。这些方法各有优劣，在耗材、试剂成本和分析时间上差异显著（表1）。

表1. 四种DAR值检测技术比较

选择方法时，信息的可靠性与技术的易用性是决定性因素。质谱法（常与HIC或RP-HPLC联用）能提供包括结构和组分在内的丰富信息，但操作复杂且数据处理耗时。

HIC、RP-HPLC和MS法的准确性往往依赖于连接子的特性，且样品前处理繁琐、试剂成本高（尤其是HIC所需的高盐缓冲液）。

相比之下，UV/Vis法操作简单、快速，可直接通过吸光度计算DAR，但传统方法通常需要对高浓度样品进行耗时且易引入误差的稀释步骤。采用称重法替代体积法进行稀释，可有效减少操作误差。

在质量控制（QC）部门，UV/Vis因其简便性成为最常用的DAR检测技术。图2直观对比了四种技术在信息质量与易用性上的表现。

图2. 各技术信息质量与易用性的比较

其中A=吸光度，ε=摩尔消光系数，c=浓度，L=光程。如果公式中加入稀释因子（DF）就变成

要计算DAR，首先必须通过联立方程来计算药物的摩尔浓度[Drug]和蛋白质的摩尔浓度[Protein]

λ（drug）指的是药物连接子的波长。Cdrug和CmAb相除得到最终的DAR结果。

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CTech^TM SoloVPE

可变光程斜率光谱法检测原理

CTech的SoloVPE采用创新的可变光程技术，通过精准调节光程，扩展了朗伯-比尔定律的适用范围，可直接、准确地测量高浓度样品，无需稀释。仪器通过移动浸入样品的光纤探头来改变光程（图3）。系统自动寻找吸光度约为1 AU的光程，随后在10个更短的光程下测量吸光度，并绘制曲线。

图3. 样品分析过程中SoloVPE的基本设置

与依赖单一绝对吸光度值的传统UV/Vis方法不同，斜率光谱法使用吸光度与光程数据来确定斜率值，并以此来计算样品浓度。斜率光谱方程通过将朗伯-比尔定律（公式1）中光程项L移到公式的左侧，得到：

A/L=ε*c（公式6）

由吸光度和光程数据的回归得到的线性方程可以被写成：

A=m*L+b（公式7）

其中m是回归的斜率，b是线性方程在Y轴上的截距。方程中斜率m的单位是Abs/mm。单位相同的前提下允许公式6的左边（A/L）直接替换为公式7中的斜率（m）

替换之后得到斜率光谱方程：

m=ε*c（公式8）

图4显示了SoloVPE系统测量和绘制的10个点。然后利用这条线的斜率来计算样品的浓度，使用公式9：

c=m/ε（公式9）

SoloVPE分析工具提供了两个关键参数：斜率和确定系数（R2）。确定系数表明实测数据与回归线相匹配的程度，保证了测量结果的可信度。

 图4. SoloVPE绘制的示例图

斜率光谱法无需稀释或背景扣除即可获得可靠、重复性高的结果，显著节省了时间并消除了稀释误差。

如表2所示，综合考虑试剂、耗材及人工时间成本，SoloVPE系统相较于传统UV方法，可节省约三分之一的成本，并将分析时间缩短一半（以5个样品各测3次平行计）。

表2. SoloVPE分析与传统UV分析的成本对比

（基于5个样品各三次平行的分析，价格基于发表当时的价格）

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SoloVPE验证方案与结果

在正式应用前，验证了SoloVPE与传统UV方法（岛津UV-1800）结果的一致性。验证对象为ADC原料药（BDS）的蛋白浓度和DAR值。通常在生产过程中的各个阶段都需要进行这种分析。

图5. ADC制造过程中所执行步骤的工艺流程图

将BDS的传统UV方法转换为SoloVPE方法，分别在248 nm（药物连接子）和280 nm（蛋白质）处测量斜率，计算蛋白浓度（mg/mL）和DAR。结果对比显示（表3），两者测得的蛋白浓度差异仅为0.3 mg/mL，DAR差异为0.1，证明SoloVPE结果与传统UV方法高度一致。

 表3. 岛津1800与SoloVPE所测蛋白平均浓度和DAR值的结果汇总

进一步对BDS样品进行了特异性、准确度、精密度和线性的方法学验证。由于SoloVPE无需稀释，验证前需将样品浓缩至合适范围。

表4显示样品的标称浓度、线性的目标范围和样品浓缩的目标浓度

 表4. 线性研究方案包含的目标值

表5显示了浓缩样品的实际浓度，该浓度是通过传统的UV方法，两名分析人员（每人重复3次）分别使用不同的分光光度计，共计重复6次平行样得到的结果。

表5. 浓缩线性样品的浓度测定

按照表5中的参数做线性稀释进行样品制备。计算出的理论浓度如表6所示，并涵盖了表4中规定的目标范围。

 表6：各线性水平下每个样品的理论浓度

特异性验证

在不同的光程下分别对抗体以及ADC样品进行全波长扫描，参考图6和图7。评估248nm和280nm处的吸光度差异。由于药物连接子的因素，ADC药物在248nm处具有比抗体更高的吸光度。

图6. 抗体测试样品在多个光程下波长扫描图谱。红色轨迹为0.005mm；浅绿色轨迹为0.05mm；紫色轨迹为0.1mm；蓝色轨迹为0.25mm；黄色轨迹为0.5mm；粉色轨迹为1.0mm；墨绿色轨迹为2.5mm，绿松石色轨迹为5.0mm

 图7. ADC测试样品在多个光程下波长扫描图谱。红色轨迹为0.005mm；浅绿色轨迹为0.05mm；紫色轨迹为0.1mm；蓝色轨迹为0.25mm；黄色轨迹为0.5mm；粉色轨迹为1.0mm；墨绿色轨迹为2.5mm，绿松石色轨迹为5.0mm

综上所述，SoloVPE与传统UV的结果相比较，所有的结果相当且符合方法的合格验收标准。因此认为SoloVPE斜率光谱法是合格的，可以使用的。

SoloVPE配套的ViPER软件已更新专门的ADC分析模块。用户仅需输入药物特征波长（本例为248 nm）及相应的消光系数，软件即可自动测量、计算并报告蛋白浓度和DAR值。使用该模块测得样品的DAR为4.1，与前述验证结果一致，证实了该模块的准确性（图8）

图8. ADC应用程序

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