小小流通池一身反骨，需要这样拿捏！

北京某顶尖高校用户，使用Sail1000 10 mL分析液相色谱系统时，由于待测物紫外吸收太强，导致峰形总是平头，无法进行正常的分析。流通池由标配的10 mm光程更换为2 mm光程，问题得到解决（客户分析方法保密，此处不便分享实验条件及色谱图）。

安徽某制药企业用户，使用EasyPure800纯化色谱系统时，中低压纯化样品同样出现过载。在不减少上样量的前提下，流通池由1 mm光程更换为0.3 mm光程，解决了样品过载问题，提高工作效率（客户分析方法保密，此处不便分享实验条件及色谱图）。

月旭工程师使用标样进行测试，同一样品在不同流通池上的表现如下图所示。

网上某用户分享实验时发现，相同浓度样品在同一型号的两台仪器上响应差异较大，经排查发现两台仪器使用了不同的流通池。

三位用户的实验问题均来自于流通池，那么小小流通池里到底蕴含着哪些奥秘呢？

流通池的选择需要根据所使用的色谱柱的内径来定，一般内径越小，流通池的体积也应该越小，否则分析物从色谱柱内部流到流通池时，发生溶剂积增大效应，导致产生很大的柱外体积效应，也会影响分离度。

在根据色谱柱以及仪器选择流通池的体积时，可按照“流通池体积小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的1/10为宜”的原则进行选择。

流通池的选择，除了应尽可能小体积之外，也应该选择长度尽量长的流通池。

使用较大的流通池可获得更佳的检测限。使用较小的流通池可以获得更佳的峰分辨率。

较大的流通池，光通量和光程比较大一些，样品通过流通池时，光敏元件上就会得到比较大的光强，并且由于光程较大，所以灵敏度就会比较高，灵敏度的增大更有利于得到较好的检测限。

较小的流通池虽然光通量较弱，但由于池径较小，光程较短，因此样品在流通池内的扩散较小，使峰的分辨率得到提高。

根据朗博-比耳定律：

光程长度越长，产生的信号强度越高。虽然噪声通常不会随着光程长度的增加而显著上升，但信噪比会得到提升。例如当光程长度从6 mm增加到10 mm时，噪声仅增加不到10%，而信号强度却提升了70%。

当增加光程时，通常会增大流通池体积——在本示例中为5-14 µL 。通常，这会导致峰扩散，但并不影响梯度分离中的分辨率。

最后为了证明以上的结论，我们再来看一个正面拿捏流通池的例子。

黄曲霉毒素的检测采用柱前衍生或柱后衍生法比较多，但是在下面两个例子中，科研人员均使用了大体积流通池，摒弃了操作繁琐且毒性大的柱前衍生和需要专用设备的柱后衍生法，仅仅使用了大体积流通池同样可以放大信号。

色谱柱：Waters acquity BEH C18柱(2.1 mm x100 mm,1.7 μm)

流动相：

A：甲醇:乙腈=50:50(V/V)

B：纯水

A:B=36:64(V/V)

流速：0.3 mL/min

柱温：40 ℃

进样量：10 mL

荧光检测器：激发波长为365 nm,发射波长为450 nm

由上图也可以看出由于使用了大流通池，柱外体积效应影响表达，峰有些拖尾。

UPLC分离柱比 HPLC分离柱出峰时间快，明显缩短了分析时间，提高了分离效率。由表1可知，适当地降低流速可提高灵敏度，但是降低流速会增加运行时间，并导致灵敏度降低，效率降低。因此，在本实验中选择流速为柱子的推荐流速，即1.0 mL/min；UPLC柱则选择流速0.3 mL/min。由于二者流速的差异，降低了UPLC流动相的使用量，试剂节约明显。

对于吸收弱的样品，为了提高响应信号强度，可以选用更长光程的流通池，以此来提高检测器灵敏度，获得更好的实验结果。

对于吸收比较强的样品，可以使用小光程的流通池，保证信号不超量程，制备时可以有更高的上样量。（声明：内容来源于网络、文献及安捷伦用户手册，仅用于交流探讨的非商业用途，请甄别参考。）

参考文献：

[1]超高效液相色谱-大体积流通池荧光法检测食品中的4种黄曲霉毒素；中国卫生检验杂志 2017年4月第27卷第8期；胡佳薇,田丽,王敏娟,王彩霞,郭蓉（陕西省疾病预防控制中心）

[2]超高效液相色谱一大体积流通池荧光法检测奶及奶制品中的黄曲霉毒素M1；浙江大学学报(农业与生命科学版)；王军淋，蔡增轩，任一平；39(2):191~196，2013