液相方法转移，为什么不能重现？

上次月旭对色谱柱重现性声明的视频得到了公司内外的广泛关注，我们也收集到了众多反馈。其中最主要的诉求是：大家认可视频中提到的内容，但整体偏笼统，对于实际问题的排查与解决帮助有限。能否进一步展开，提供更具体、更可操作的内容？

对此，公司组织了多次跨部门讨论，并由与一线用户工作最接近的应用部进行总结整理，形成了本文内容。需要特别说明的是：本次讨论基于月旭长期的经验积累，更偏向于实战中容易被忽略的因素（以应用层面为主），并不局限于色谱柱本身，欢迎各位同行与用户共同探讨、指正。

从本质上讲，只有当色谱条件完全不变时，才能获得完美的重现性。请注意，这里所指的“色谱条件完全不变”，不仅仅指我们实验记录中的那些！

为了方便讨论，我们将色谱系统粗略地分为试剂、样品、仪器和色谱柱四个部分进行分析。同时，为了使问题更具讨论意义，我们忽略随机误差这一不可避免的因素，并在假设方法合理且具有一定容差能力的前提下，探寻影响实验结果的各类因素，从中找出导致重现性问题的原因。

2）某些试剂具有特殊不稳定性

乙酸铵：其性质（尤其是配制成溶液后的 pH 值）非常不稳定。即使是全新开封，不同瓶之间的差异也可能大到足以影响实验结果。

纯化水：水对于实验室来说是一个非常特殊的试剂。多数试剂可以直接购买相应纯度的成品，但是水，而水通常需要通过纯水机自制，或直接使用市售饮用纯净水。

经验的实验人员都知道，纯化水的理化性质波动较大，且检测指标繁多，这也是试剂级纯化水价格较高的原因之一。因此需要明确：纯水机产出的18.2 兆欧水，并不代表完全没有问题，电导率仅仅是评价水质的一个指标。

（温馨提示：我国地域广阔，不同地区水质差异明显，外出实验时需格外注意。）

我们发现，很多用户会误认为：只要被测物的主要成分相同，方法就是通用的。但实际上，色谱的根本目的是分离。即使主要被测成分相同，只要样品中其他组分存在差异（不仅包括被测杂质，还包括辅料、基质、溶剂等），对色谱条件的要求就会不同。

这也是我们经常看到原料药与制剂在前处理方法和检测方法上存在显著差异的原因之一。由此可见，当样品发生改变时，原有的色谱条件往往不再适用，常见影响包括：

▪ 样品溶剂或进样体积的变化，会引入不同程度的溶剂效应；

▪ 辅料、基质种类或含量的变化，不仅会影响检测结果，甚至可能对色谱柱造成直接损伤；

（这也是为什么在制剂分析和食品分析中，尽管前处理过程复杂繁琐，但相关色谱柱的使用寿命仍普遍偏低的原因之一）；

▪ 研发阶段的反应液，其组成和浓度差异极大，检测结果出现波动也就不足为奇。

仪器是色谱系统中最昂贵的组成部分，目前多数实验室使用的也都是进口品牌设备，因此我们往往对其信任度较高，进而容易忽略由仪器带来的差异。

但不可否认，几乎所有从业者都遇到过这样的情况：更换一台仪器，或同一台仪器经过维修后，实验结果发生变化。

1. 死体积

死体积的负面影响大家已较为熟悉，这里不再赘述。在此特别分享一个在实际应用中观察到的“特殊现象”：当从进样器到色谱柱入口的死体积较大时，样品与流动相在这一段中的混合会更加充分，从而在一定程度上削弱溶剂效应。

而如今的新型仪器普遍追求更小的死体积，这也是为什么新型号仪器有时反而更容易出现溶剂效应的原因之一。

2. 实际流动相比例

在等度条件下，色谱柱内环境保持不变，只要仪器提供的溶剂比例足够准确，通常不会产生明显问题。获取流动相的方式主要有两种：

1）人工配置 + 单相运行

这种方式只要操作规范，一般具有良好的稳定性。

2）仪器在线混合

不同设计的仪器在在线混合溶剂时，实际输出的比例可能存在差异：低压混合系统在某些相比例较小时，误差会明显增大；此外，不同仪器泵模块的设计及混合逻辑差异，也会导致实际输出的溶剂比例不同（例如部分采用校正因子，部分采用预压缩技术）。

3. 梯度条件下的复杂性

在梯度条件下，问题会显著放大。由于色谱柱内的流动相环境是连续变化的，且同一时刻柱内不同位置的环境并不一致，因此，只有严格控制每一时刻的柱内环境，才能获得理想的重现性。

这就要求：输送至色谱柱入口的溶剂比例与流速，必须与时间严格一一对应。

其中，流速之所以重要，是因为它直接影响梯度过程中柱内环境的变化速率；而在等度条件下，由于选择性保持不变，微小的流速差异通常不会显著影响结果。

4. 梯度“并非你看到的那样”

需要特别注意以下几点：

1）梯度延迟

我们在梯度表中设置的参数，控制的是仪器各模块执行动作的时间，而并非流动相真正到达色谱柱入口的时间。

2）梯度并非真正连续

尽管方法中设定的梯度曲线是连续平滑的（无论是线性还是曲线），但由于液相系统采用往复式柱塞泵，在单次冲程中输出的溶剂比例是固定的，因此实际梯度变化呈现为“阶梯状”，而非真正连续变化。

3）不同仪器 = 不同梯度曲线

结合不同泵模块设计及控制逻辑的差异，不同仪器实际输出的梯度曲线必然存在差别。在缓梯度方法中，这种差异往往会被进一步放大。

首先声明，虽然月旭作为老牌色谱柱生产厂家，但由于色谱行为高度微观，且目前理论体系仍不完善，接下来的讨论主要基于宏观参数与理论分析，更多是为大家提供一种分析思路。

1. 柱管

虽然柱管设计对色谱柱性能具有重要影响，但由于其各组件加工相对成熟，因此质量波动通常较小。在未更换柱管型号的情况下，其对色谱行为的影响一般有限。

2. 填料

（以下讨论均基于控制变量前提，不再逐一说明）

我们从填料的常见参数来进行分析：

金属含量：晶格中的金属元素会影响硅胶的晶体结构，进而影响表面硅醇基的活性，其变化会对后续键合过程以及使用过程中的色谱行为产生影响，因此需要严格控制。

但对于某些对金属高度敏感的化合物（如螯合剂），即使是金属残留的微小变化，也可能带来显著影响，需要特别关注。

粒径分布：粒径分布对色谱性能影响显著，但这种影响具有普适性，即会体现在所有被测物上。因此，通过标准品测试通常可以有效识别该类问题。

孔径：标称孔径为平均值，实际孔结构在尺寸与形状上均存在差异。只要被测物分子尺寸不足以在进出孔道时产生明显阻力，孔径在一定范围内的变化通常不会对实验结果产生显著影响；对于大分子化合物，建议选择更大孔径的色谱柱。

比表面积：比表面积越大，吸附面积越大，对应的保留能力也越强。在键合密度不变的前提下，等度条件下选择性通常不会改变，仅表现为保留时间的变化。

但在梯度方法中，由于保留时间的变化可能导致化合物洗脱时对应的流动相比例发生改变，理论上可能对选择性产生一定影响。不过在非极端差异条件下，一般不会产生明显影响。

孔容积：孔容积改变了柱内的实际空腔体积。在等度条件下影响较小，而在梯度条件下可能产生一定影响；但在非极端情况下，通常不会造成明显问题。

碳载量：键合密度决定载碳量，从而影响空间位阻，进而可能改变某些极端化合物的选择性。即使碳载量相同，不同位置的键合密度仍可能存在差异，因此选择性仍可能发生变化。

月旭的产品，尤其是经典系列的碳载量，均基于大量实验验证与长期市场反馈确定。在合理误差范围内，可将键合不均匀对绝大多数化合物的影响降至最低。

3. 色谱柱的装填

该因素的影响具有普适性，通常可通过出厂时的柱效测试进行有效控制。

以上是我们对色谱工作中常见且易被忽视变量的总结，希望能为问题排查提供更广阔的思路。在实际工作中，遇到问题应冷静分析、逐步排查，而不是第一时间无依据地归因于某一单一因素。

月旭并未执着于成为最大的色谱耗材公司，而是始终致力于成为最懂客户需求的色谱耗材公司。今后在实验中如遇到问题，无论是否与我们的产品相关，均欢迎随时与我们交流探讨。