1 分钟完成 384 孔电转！看 CRISPR 筛选如何锁定 TGF-β纤维化关键靶点

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这篇文献《Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells》发表于《ACS Chemical Biology》2022 年第 17 卷，研究团队通过高通量 CRISPR/Cas9 全基因组筛选技术，探索了 TGF-β诱导的肝纤维化在人类肝星状细胞（HSCs）中的驱动机制。以下是文献 的核心内容解读：

肝纤维化的临床重要性：肝纤维化是慢性肝病的晚期阶段，可发展为肝硬化、肝衰竭或肝癌，目前尚无获 批的特效疗法。TGF-β是促纤维化的关键细胞因子，但因其广泛的生理功能，直接靶向 TGF-β可能引发毒性 副作用。

研究目标：通过 CRISPR/Cas9 筛选，鉴定 HSCs 中介导 TGF-β诱导纤维化的关键基因，寻找潜在的治疗靶点。

图示解读如下： 

RNP 复合物制备：crRNA 与 tracRNA 退火后加入 Cas9 蛋白形成 RNP 复合物； 

电转递送：使用 Lonza HT 核转染仪将 RNP 复合物电转入人 HSCs； 

细胞培养：将细胞转移至黑色透明底检测板（每孔双重复），使每个 CRISPR 文库孔实际完成四重复检测； 

基因编辑：37°C 培养 48 小时完成 CRISPR 编辑； 

表型诱导：血清饥饿 16 小时后，用 10 ng/mL TGF-β模拟刺激 48 小时； 

检测分析：固定细胞并进行 ACTA2 一抗和二抗染色，最后成像。 

初筛完成后，对候选基因进行以下验证： 

确认性筛选：采用与初筛相同的 ACTA2 检测方法； 

反相筛选：通过细胞活力实验排除假阳性； 

正交验证：经其他独立实验进一步筛选确认的靶基因。

1,CRISPR/Cas9 高通量筛选平台： 

细胞模型：使用商业来源（Lonza 和 ScienCell）的原代人类 HSCs，以 ACTA2（α-SMA）表达作为 HSC 活 化的标志物。 

筛选流程： 

(1) 通过电穿孔将 crRNA/tracrRNA/Cas9 复合物（RNP）递送至 HSCs。 

(2) 使用阵列式（arrayed）CRISPR 筛选，覆盖 19,027 个基因。 

(3) 通过高内涵成像分析 ACTA2 蛋白表达水平的变化。 

2,验证实验： 

初筛与验证：从初筛中选出 372 个显著抑制 ACTA2 表达的基因，进一步验证其功能（如细胞活性和纤维化 标志物表达）。 

多组学分析： 

转录组：通过 Nanostring 分析纤维化相关基因的表达谱。 

临床相关性：利用 UK Biobank 数据库分析目标基因与肝纤维化标志物（如 APRI 和 NFS）的遗传关联。 

类器官模型：在 HemoShear 的仿生肝脏共培养系统中验证基因表达变化。

3, 工具化合物验证： 测试蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米、ixazomib）对 HSC 活化的影响，发现某些抑制剂可降低 ACTA2 表达 且不引起细胞毒性。

关键靶点鉴定： 

初筛发现 372 个基因显著抑制 ACTA2 表达，包括已知的 TGF-β通路基因（如 TGFBR1、SMAD3/4）和新型 基因（如 PSMC2、TPM1）。 

通过验证实验确认 52 个基因具有潜在治疗价值，涉及蛋白酶体、转录调控、细胞骨架等功能类别。 

蛋白酶体亚基的潜在作用： 

敲除蛋白酶体亚基基因（如 PSMC2）显著抑制纤维化标志物表达。小分子抑制剂（如 ML557）可选择性抑 制 ACTA2 而不引起细胞凋亡。

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