生物药递送系统：mRNA 脂质纳米颗粒技术的最新发展

脂质纳米颗粒介导的寡核苷酸和 mRNA 的递送

基于 RNA 的治疗的最佳递送系统应允许以简单且非侵入性的方式递送至体内，避免不必要的免疫反应，允许穿透组织和生物屏障（例如血脑屏障，BBB），提供细胞和组织特异性，在细胞外和细胞内环境中提供稳定性，参与快速细胞渗透，有效定位于亚细胞区室，并允许靶向寡核苷酸特异性结合（在靶/脱靶比率）并稳定地结合到预期目标，包括与细胞机制的完全兼容性以及对非目标细胞过程的非常有限的干扰。功能分子与RNA的共价缀合、小分子缀合、碳水化合物缀合、疏水性分子缀合、肽缀合和适体缀合都已作为RNA载体进行了测试。

基于脂质的纳米颗粒是应用于 RNA 递送的最成熟的纳米颗粒系统之一。通过封装 RNA，LNP 可以保护载荷免受细胞外核酸酶的影响，从而将未修饰的寡核苷酸安全地递送至细胞。寡核苷酸与阳离子脂质（例如 1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵-丙烷 (DOTMA) 和 1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷 (DOTAP)）络合，中和电荷，缩合长寡核苷酸链，并在与两性离子脂质（例如 1,2-二油酰-sn-3-磷酸乙醇胺 (DOPE) 和二油酰磷脂酰胆碱 (DOPC)）混合时改善封装。仅通过 DOTMA 或其它阳离子脂质复合的寡核苷酸的递送被称为脂转染，并且它是最流行的体外转化方法。不幸的是，大多数脂转染试剂由于其高细胞毒性而不适合体内递送，因此使得脂质体制剂更适合治疗应用。

LNP 现在主要由以下四种脂质成分配制而成：（i）封装载荷的辅助脂质，（ii）增强内体逃逸和递送的可电离脂质，（iii）促进稳定性的胆固醇，以及（iv）脂质锚定的聚（乙二醇）（PEG）可减少免疫系统识别并改善生物分布。可以添加其它靶向部分，例如抗体和肽，以进一步直接定位。脂质成分通常通过冲击射流（Pfizer和moderna 采用的技术路线）混合与 mRNA 结合形成 LNP。

最近开发了一种新的方法，可以将核酸可控地递送至靶组织，称为选择性器官靶向（SORT）。SORT LNP 包含 SORT 分子，这些分子被发现可以在静脉注射后精确调节小鼠肝脏、肺和脾脏的递送。纳米颗粒可以通过需要不同设计标准的被动、主动和内源性靶向机制来设计，以靶向体内的特定细胞和器官。SORT LNP 是模块化的，可以使用可扩展的合成化学和既定的工程配方方法来制备。

尽管如此，LNP 仍然面临一些递送障碍，包括非特异性血清蛋白相互作用、快速清除、脱靶定位和内体降解。此外，mRNA 递送会诱导瞬时蛋白质产生，需要重复施用才能持续表达。最后，抗 PEG 抗体的开发引起了人们对 LNP 潜在过敏反应的担忧。Pfizer – BioNTech BNT162b2 和 Moderna mRNA-1273 m疫苗RNA针对 COVID-19、病毒 mRNA 或其寡核苷酸，可能发挥双重作用，包括强效促炎活性，反之亦然，免疫抑制，具体取决于剂量和主要靶细胞类型，因为与 Toll 样受体 (TLR) 的直接相互作用，后者是一类在先天免疫系统中发挥关键作用的蛋白质。

应用

转录后基因沉默以 mRNA 转录物为目标并降解，从而沉默特定基因的表达。使用合成且结构明确的短双链RNA（小干扰RNA（siRNA））的RNA干扰技术近年来迅速发展。

Patisirean 的商品名为 Onpattro，是一种用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性患者的多发性神经病的药物，这是一种致命的罕见疾病，估计影响全球 50,000 人。Onpattro是一种RNA干扰药物，是FDA批准的第一个核酸LNP治疗药物，用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病。它是一种基因沉默药物，可干扰异常形式的转甲状腺素蛋白的产生。Patisiran 采用一种新方法，通过 RNA 干扰途径靶向并减少肝脏中转甲状腺素蛋白的产生。Patisiran 的 siRNA 活性成分被配制为脂质纳米颗粒，可保护 RNA 并促进其递送至靶组织。脂质纳米颗粒制剂包括缓冲液成分以及脂质成分DLin-MC3-DMA、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇化脂质DMG-PEG 2000。针对转甲状腺素蛋白淀粉样变性的 CRISPR-Cas9 体内基因编辑方法也在一项临床试验中进行研究（由 Intellia Therapeutics 和 Regeneron Pharmaceuticals 资助）。

同样，丙型肝炎病毒感染继发的肝纤维化可导致肝硬化和肝功能失代偿。直接作用的抗病毒药物治疗方案可以实现持续的病毒学应答；然而，晚期纤维化患者患肝细胞癌的风险增加。热休克蛋白 47 (HSP47) 是一种关键的胶原伴侣，与纤维化的发展有关。BMS-986263 是一种脂质纳米颗粒，可递送小干扰 RNA，旨在降解 HSP47 mRNA，用于治疗晚期纤维化，其有效性和安全性已有数据。NCT03420768 是一项随机 (1:1:2)、2 期安慰剂对照试验，正在美国一家肝病诊所进行。HCV-SVR（≥1 年）和晚期纤维化患者每周接受一次静脉注射。输注安慰剂或 BMS-986263（45 或 90 mg），持续 12 周。

在一项首次人体研究中，发现对狂犬病病毒糖蛋白 (RABV-G)-mRNA 疫苗的免疫反应取决于给药途径，因此需要专门的设备。继对脂质纳米颗粒 (LNP) 封装的 mRNA 进行成功的临床前研究后，目前正在临床试验中研究 mRNA-LNP 制剂 (CV7202)（ClinicalTrials.gov 标识符：NCT03713086）。

Pfizer-BioNTech 和 Moderna mRNA-LNP COVID-19 疫苗于 2020 年获得 FDA 紧急使用授权，紧接着2款疫苗也获得正式获批，二者均采用了德国knauer IJM设备作为商业化LNP生产。

吸入 LNP 通过蛋白质靶标 CFTR 治疗囊性纤维化的临床前和临床研究正在进行中。

尽管取得了重大成功（例如，针对 SARS-CoV-2 开发了 mRNA 疫苗来控制 COVID-19 大流行），但其它疾病的治疗方法的开发仍然受到寡核苷酸向特定组织和器官的低效递送以及通常令人望而却步的成本而在最终开发为药物时存在限制。当针对多因素疾病和患者特异性生物学变异时，这一点更为重要。

例如，在囊性纤维化中，尽管脂质 LNP 在有效和安全地递送 mRNA 疫苗方面取得了成功，但开发基于吸入的 mRNA 肺部疾病疗法仍然具有挑战性。由于雾化过程中的剪切应力，LNP 往往会崩解，导致递送无效。因此，LNP 需要在雾化和粘液渗透过程中保持稳定，但又足够不稳定以利于内体逃逸。为了满足这些相反的需求，PEG 脂质可用于增强 LNP 的表面稳定性，其中包含胆固醇类似物 β-谷甾醇，以改善内体逃逸。研究发现，LNP 中 PEG 浓度的增加可以增强剪切阻力和粘液渗透性，并且 β-谷甾醇可以为 LNP 提供多面体形状，促进内体逃逸。优化的 LNP 表现出均匀的颗粒分布、多面体形态、快速粘膜扩散以及增强的基因转染。吸入 LNP 导致小鼠肺部局部产生蛋白质，而没有肺部或全身毒性。重复施用这些 LNP 可导致肺部持续产生蛋白质。最后，编码囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）的 mRNA 在雾化后被递送至 CFTR 缺陷的动物模型，导致该治疗蛋白在肺部表达。这项研究展示了基于吸入 LNP 的 mRNA 疗法临床转化的合理设计方法。

有趣的是，虽然市场上所有的 siRNA 药物都以肝脏为靶点，但肺部却提供了多种目前无法用药物治疗的靶点，可以用 RNA 疗法进行治疗。因此，RNA纳米颗粒的局部肺部递送最终可以实现肝脏以外的递送。靶向药物递送技术增强了吲哚衍生物在小鼠囊性纤维化环境中的整体治疗效果。通过干粉吸入器施用 RNA 药物具有许多与 RNA 和纳米混悬剂的物理、化学和微生物稳定性相关的优点。因此，最近的一项研究旨在测试喷雾干燥 LNP 粉末工程的可行性。使用5%乳糖溶液（m/V）进行喷雾干燥，目标是喷雾干燥粉末再分散后获得的纳米颗粒尺寸为150 nm左右，残留水分含量低于5%，在维持 RNA 生物活性水平时RNA损失低于 15%。LNP 由可电离的阳离子脂质（DLin-MC3-DMA 的含硫类似物）、辅助脂质、胆固醇和PEG-DMG 组成。该研究验证了 LNP-siRNA 系统的成功喷雾干燥程序，同时保持其完整性并在体外和离体的 mRNA 和蛋白质水平上介导强大的基因沉默效率。

总体而言，mRNA疫苗或其它形式的治疗之所以如此强大，在于mRNA治疗技术的诸多优势。(1)安全性：与DNA需要进入细胞核不同，mRNA在细胞质中发挥作用，从而避免了其整合到宿主基因组中的风险。（2）高效率：适当的修饰调控和序列优化可以显著提高mRNA的稳定性和翻译效率，并且开发了高效的递送系统，以实现mRNA的快速摄取和细胞质表达。（3）开发周期短：一旦确定了病原体的基因组序列，就可以设计编码抗原蛋白的mRNA，并在体外产生mRNA的转录本，无需细胞扩增，这显著提高生产速度。（4）灵活性高：在病毒发生突变导致原有疫苗失效的情况下，可以根据新的病毒序列快速重新设计生产新的mRNA疫苗。（5）应用广泛：mRNA技术凭借先进的原理和高效的研发、生产，在传染病、遗传病、肿瘤、糖尿病等治疗方面正在取得突破性进展。

未来的方向

尽管如此强大，LPN 制剂仍然存在重大未解决的问题，包括 LNP 递送的生物障碍、组织积累、延长蛋白质表达的维持、免疫反应和内体逃逸。LNP 的表面电荷是一项附加功能，可以根据靶向能力进行定制。阴离子载体已用于脑治疗；在一项比较研究中，Gabal 等人的结果显示，阴离子纳米结构脂质载体的脑靶向效率比阳离子脂质载体高 1.2 倍。然而，由于核酸包装困难和转染效率差，阴离子颗粒具有局限性。Tagalakis等人研究表明聚乙二醇化增强了阴离子纳米复合物受体介导的转染效率。他们使用阳离子靶向肽作为 pDNA 和聚乙二醇化阴离子脂质体之间的连接桥梁。不出所料，新产生的结构在血清和转染细胞中都表现出更强的抗聚集性。与同源、非聚乙二醇化阴离子和阳离子系统相比，他们还证明了组织渗透水平更高，细胞转染范围更广。阴离子整合素靶向混合纳米载体也被探索用于神经母细胞瘤的 siRNA 治疗，以降低全身和细胞毒性，并且肝脏清除率最小。研究发现，阴离子受体靶向纳米复合物与其阳离子等效物一样具有特异性和效率。这在动物模型中也很明显，因为阴离子受体靶向纳米复合物以整合素介导的方式转染肿瘤，并有效进入肿瘤，几乎没有脱靶生物分布。

结论

mRNA 最近成为治疗和预防从肿瘤、阿尔茨海默氏病到 COVID-19 等疾病的一种有吸引力的替代方案，并具有显著的临床成果。体外转录的 mRNA 已被设计为模仿天然 mRNA 的结构，用于疫苗接种、肿瘤免疫治疗和蛋白质替代治疗。在过去的几十年里，在揭示 mRNA 的分子途径、控制其可翻译性和稳定性以及理解其进化防御机制方面取得了重大进展。然而，许多未解决的结构、生物学和技术难题阻碍了 mRNA 系统递送的成功实施，以供人类安全消费。为了解决未解决的问题并充分发挥 mRNA 药物的潜力，必须在设计和生产 mRNA 以及选择创新的递送载体方面取得进展。

目前 mRNA 疗法的进展以及生物材料和递送策略设计的进展，包括纳米和微米级生物药物递送系统，可能有助于应对现有的临床可处理性转化挑战，并有望克服与 mRNA 相关的任何挑战。目前纳米医学研究正在寻求通过仿生学来改进 LNP 和其它传统纳米颗粒设计。仿生和仿生纳米颗粒系统是通过利用自然存在的生物结构的解决方案来设计的，这些生物结构的发展是为了克服特定的挑战。纳米颗粒利用仿生学的方式可以有很大差异。

原文：M.Puccetti, A.Schoubben, S.Giovagnoli, et al., Biodrug Delivery Systems: Do mRNA Lipid Nanoparticles Come of Age? International Journal of Molecular Sciences, 2023.