08- 揭秘mRNA疫苗冻干技术，实现室温稳定12周

今天，我们聚焦一篇2022年发表于《Molecular Therapy》的重磅研究，由宾夕法尼亚大学的Norbert Pard团队带来的：“Lyophilization provides long-term stability for a lipid nanoparticle-formulated, nucleoside-modified mRNA vaccine”。

尽管mRNA-LNP疫苗在抗击新冠疫情中大放异彩，但其极度依赖超低温冷冻储存的“卡脖子”痛点，严重限制了其在全球欠发达地区的普及。本研究另辟蹊径，巧妙地利用特定的双糖冻干保护剂（10%蔗糖+10%麦芽糖）结合精准的冷冻干燥工艺，成功将复杂的核苷修饰mRNA-LNP转化为稳定的“冻干粉”。实验取得了令人振奋的突破性成果：重溶后的疫苗在室温（25°C）下储存12周或在4°C下储存长达24周，不仅完美保持了颗粒大小和高包封率，其在体内的翻译效率和激发强效抗体（HAI滴度）的免疫原性也未发生衰减。这项工作彻底打破了mRNA疫苗的“冷链魔咒”，为下一代纳米基因药物的全球无障碍分发提供了关键的通用解决方案。

图1：物理化学表征——冻干工艺如何锁住LNP的“完美形态”

脂质纳米颗粒（LNP）并不是简单的水溶液，而是由四种特定脂质按严格比例精心组装的复杂三维超分子结构。在冻干过程中去除水分极易导致颗粒破裂、聚集或药物泄漏。为了“稳住”这个精密的结构，研究团队将LNP置换到含有10%蔗糖和10%麦芽糖的缓冲液中，并在-45°C至30°C的真空环境中进行精密干燥，最终得到了外观优雅、致密洁白的冻干饼块（Cake），加水后瞬间即可恢复成透明泛蓝光的乳液。

从图1的表征数据可以看出，储存在4°C及以下的冻干LNP在长达24周的时间里，其粒径（约100nm左右）和多分散性指数（PDI < 0.10）如磐石般稳定，毫无聚集迹象（图1A/B）。即便是最敏感的指标——mRNA完整性（RNA integrity），在4°C下存放24周也仅下降了约10-15%；在室温（25°C）下虽下降约30%，但总mRNA浓度和高达90%以上的包封率（图1C/D）依然保持坚挺。只有在42°C的极端高温下，颗粒才出现了显著变大和RNA降解。这表明，特定的糖类组合如同给LNP穿上了一层“分子铠甲”，在常温下有效抵抗了物理崩塌和化学降解。

图2：活体荧光成像——重溶后的mRNA-LNP在体内依然“电力十足”

保住了物理形态只是第一步，冻干重溶后的LNP还能否顺利进入细胞并释放mRNA进行翻译？为了直观展示这一点，研究人员将编码萤火虫荧光素酶（Luc）的mRNA包封进LNP，对小鼠进行肌肉注射（IM）和皮内注射（ID），并通过活体发光成像追踪蛋白质的表达。

图2的数据给出了极其响亮的回答。在第4周时，无论是储存在4°C还是室温（25°C）下的冻干LNP，重溶注射后均激发出与新鲜冷冻组几乎同等强度的生物荧光信号（图2B、2C）。当时间拉长到24周的极限挑战时（图2D、2H），4°C储存的冻干LNP依然保持了极高水平的蛋白表达，证明其细胞摄取和内体逃逸能力未受影响。即便室温储存24周后活性有所下降，但也远优于42°C彻底失效的情况。这从生物学功能层面硬核证明：科学的冻干工艺不仅没有破坏LNP的“运载能力”，反而将其巅峰状态冻结在了时间里。

图3：免疫原性验证——真实疫苗场景下的硬核抗体反应

为了探究其在真实疫苗应用中的防线构建能力，团队进一步制备了针对流感病毒（PR8 HA）的mRNA-LNP疫苗。衡量流感疫苗效力的金标准是血凝抑制（HAI）滴度，它直接反映了疫苗诱发中和抗体的能力。

从图3的横向对比中我们惊喜地发现，在经过4周、12周甚至24周的长途跋涉后，4°C储存的冻干疫苗在小鼠体内激发的抗体滴度，与一直保存在-80°C的“新鲜”液体疫苗毫无统计学差异（图3A-D）！更令人瞩目的是，即便是放在室温（25°C）下足足12周（图3C），疫苗的免疫原性也没有出现任何下降。虽然前文提到室温下mRNA的完整性会有一定折损，但这并未影响最终的免疫效果，说明该制剂不仅稳定，还具备极高的容错率。此外，这种冻干LNP一旦重溶，在室温下至少24小时内依然保持理化性质稳定，远超目前商用新冠疫苗重溶后仅能维持数小时的局限，极大方便了临床接种操作。

核心科学思想： 本研究的核心哲学在于“热力学干预与空间位阻保护的双管齐下”。面对极其脆弱的由四种脂质非共价组装的动态纳米结构，研究人员没有选择去改变LNP本身的基础配方（这往往会影响成药性），而是巧妙地通过外部环境的重塑——利用双糖体系（蔗糖+麦芽糖）在冷冻和脱水过程中形成的玻璃态基质，为纳米颗粒提供了强大的空间位阻，防止颗粒融合；同时抽干水分，阻断了mRNA水解的化学途径，从而实现了从“极寒续命”到“常温长存”的升维打击。

背景与横向对比： 回看市面上的商用mRNA疫苗：Moderna的Spikevax需要在-15°C至-20°C保存，而Pfizer/BioNTech的Comirnaty更是苛刻到了-60°C至-80°C。此前虽有少数团队尝试冻干LNP（如Tekmira治疗埃博拉的siRNA-LNP），但在mRNA领域的长效稳定性数据一直欠缺，甚至有研究报道冻干后药效大幅下降。本文以详实的数据（长达半年的理化与活体追踪）首次全面证实了：只要冻干工艺与缓冲液匹配得当，核苷修饰的mRNA-LNP完全可以在普通冰箱甚至室温下实现长期储存。

深刻见解与未来展望： 虽然4°C半年、室温3个月的稳定性已是巨大飞跃，但我们也应注意到，在42°C中，RNA依然发生了严重降解（超70%）。未来的研究方向或可聚焦于两个维度的优化：一是探索新型耐热水解的离子化脂质（Ionizable lipids），从根源上减少脂质降解产生的副产物对mRNA的攻击；二是优化mRNA分子的二级结构，提升核酸本身的抗降解能力。随着冻干工艺的进一步工业化放大，我们完全有理由相信，mRNA疫苗跨越赤道、送达地球上每一个偏远村落的愿景，已经近在咫尺。

Muramatsu H, Lam K, Bajusz C, Laczkó D, Karikó K, Schreiner P, Martin A, Lutwyche P, Heyes J, Pardi N. Lyophilization provides long-term stability for a lipid nanoparticle-formulated, nucleoside-modified mRNA vaccine. Mol Ther. 2022 May 4;30(5):1941-1951. doi: 10.1016/j.ymthe.2022.02.001. Epub 2022 Feb 4. PMID: 35131437; PMCID: PMC8815268.