14-薄膜冷冻干燥技术完美“冻存”带泡状结构的脂质纳米颗粒

今天，我们聚焦一篇发表于《Journal of Controlled Release》的重磅研究，由德克萨斯大学奥斯汀分校崔正荣教授团队与诺贝尔生理学或医学奖得主、宾夕法尼亚大学Drew Weissman教授团队联合带来的：“Thin-film freeze-drying of an influenza virus hemagglutinin mRNA vaccine in unilamellar lipid nanoparticles with blebs”。

现有的mRNA-LNP疫苗被死死卡在“超低温冷链储运”这一“卡脖子”环节上。更棘手的是，这些临床批准的LNP表面往往带有脆弱的“泡状结构（blebs）”，在传统冻干的冷冻和脱水应力下极易破裂、聚集并导致mRNA泄漏。为了从内部攻破这一壁垒，研究团队另辟蹊径，引入了超快速的“薄膜冷冻干燥（TFFD）”技术，并精心复配了保护性辅料矩阵。结果表明，采用优化配方制备的冻干粉，不仅完美保留了LNP极其脆弱的原始形貌和高达95%的包封率，还在小鼠体内激发出与原液疫苗毫无二致的强效免疫反应。这项工作为彻底摆脱冷链束缚、开发可室温储运甚至吸入式给药的下一代mRNA疫苗奠定了坚实的科学基石。

图2. 精准配方“护航”：高浓度辅料是锁住mRNA-LNP结构的“防弹衣”

临床使用的mRNA-LNP并不是完美的实心圆球，而是在单层脂质双分子层外包裹着一些像水泡一样的突起结构（blebs）。这种结构虽然利于功能发挥，但极其“娇气”，一冻就碎。研究人员发现，单纯使用薄膜冷冻干燥（TFFD）还不够，必须给LNP穿上合适的“防弹衣”——冻干保护剂。

在这个环节，团队测试了从P24到P31等一系列不同浓度的辅料配方（蔗糖、海藻酸、亮氨酸和P188的组合）。结果非常震撼：当辅料总浓度较低（如P31，仅2.5%）时，LNP在复溶后出现了明显的聚集和融合（图2E）；而当辅料浓度拉高到约27%（P24配方）时，奇迹出现了。P24不仅保持了高达95%的mRNA包封率，更关键的是，通过冷冻电子显微镜（Cryo-EM）观察（图2B），那些娇弱的“泡状结构（blebs）”完好无损，颗粒之间没有任何融合的迹象。高浓度的糖类和聚合物在冰晶形成时撑起了一把保护伞，成功抵御了冷冻和干燥带来的机械应力。

图3. 洞悉颗粒内部：小角X射线散射（SAXS）揭示“核-壳”结构的隐秘细节

常规的电镜只能看清“皮囊”，颗粒内部的mRNA核有没有散架？我们需要透视眼。研究团队引入了小角X射线散射（SAXS）结合DENSS算法，直接重建了LNP的3D电子密度图。

在图3B中，暖色调（黄/红）代表电子密度极高的区域，即致密的mRNA核心；冷色调（绿/蓝）则是脂质外壳。令人惊叹的是，原始液体LNP和经P24配方冻干复溶后的LNP，其内部电子密度分布几乎一模一样——一个完整、均匀的mRNA高密度核心稳稳地待在中央。相反，辅料浓度稍低的P25配方，虽然外观看着还行，但在SAXS透视下，其内部的mRNA富集相已经开始出现了“碎片化（fragmentation）”。这从更深邃的分子维度证实了：足量的特定辅料组合，是锁定mRNA-LNP复杂内部三维架构的核心密码。

图4. 粉体微观奥秘：无定形玻璃态与多孔骨架成就极致复溶

优质的冻干粉不能是坚硬的冰块或结晶体，它必须具备极佳的复溶性。团队使用X射线粉末衍射（PXRD）、调制差示扫描量热法（mDSC）和扫描电镜（SEM）对干粉的物理性质进行了全面体检。

图4A和4B的数据清楚地表明，P24和P25粉末都处于完全的“无定形（amorphous）”玻璃态。你可以将其想象为一种时间被冻结的高级糖浆，这种状态剥离了破坏性的结晶过程，将LNP极其温柔地包裹在固体基质中。同时，SEM图像（图4C）揭示了薄膜冷冻干燥（TFFD）的独特优势：粉末呈现出高度多孔的纳米结构网络。正是这种“蓬松”的海绵状多孔骨架，使得干粉在遇到水的一瞬间就能迅速溶解，完美释放出被封印的mRNA-LNP。

图5. 终极实战检验：冻干疫苗体内免疫效力“不降级”

无论体外表征多完美，疫苗的最终考场始终在体内。研究团队将装载了流感病毒血凝素（HA）mRNA的LNP进行了动物试验。

他们给小鼠肌肉注射了0.1 μg极低剂量的疫苗。图5的战报令人振奋：无论是高辅料的P24，还是低辅料的P25，经过极端冷冻干燥折磨后复溶的疫苗，依然在小鼠体内激发出极其强悍的免疫反应。更重要的是，它们产生的HA特异性结合抗体滴度（图5A）以及更为关键的血凝抑制（HAI）中和抗体滴度（图5B），与一直泡在缓冲液中妥善保存的“原版”液体疫苗相比，没有任何统计学上的差异。这标志着，TFFD冻干技术在彻底改变疫苗物理形态的同时，完美保留了其核心的生物学药效。

通读这篇文章，我们不仅看到了技术上的突破，更能从中汲取指导未来药物递送系统设计的深刻智慧：

核心科学思想： 传统的LNP设计往往只关注转染效率，但走向临床转化时，储运稳定性是跨不过的坎。本文深刻指出，临床mRNA疫苗那种“带泡的单层双分子层（unilamellar with blebs）”结构，天生就比多层球体更脆弱。面对这种脆弱性，单纯改变化学处方是不够的，必须在热力学工艺上做文章。TFFD技术（100-1000 K/s的极速冷冻）结合复合糖类/聚合物的“玻璃态锁定”，提供了一种物理与化学双管齐下的终极护航策略。

背景与横向对比： 在此之前，大多数研究试图用传统的搁板冷冻干燥（极慢冷冻，导致破坏性的大冰晶和相分离）处理mRNA-LNP，结果往往是颗粒粒径剧增（有时激增62%以上）和mRNA大量泄漏。本文采用的TFFD技术彻底颠覆了这一现状，将粒径变化降到了极低水平，并将包封率维持在95%的惊人高度，这是该领域冻干制剂工艺的一次显著代差级提升。

深刻见解与未来展望： 这篇文献不仅解决了冷链痛点，还推开了一扇更大的门。TFFD制备出的极低密度、高孔隙率且质地脆弱的冻干微粒，具有极佳的空气动力学特性。这意味着什么？这意味着我们未来或许不需要把冻干粉复溶注射，而是可以直接将其制成吸入式干粉吸入剂（DPI）或鼻喷剂，直接递送至肺部或鼻黏膜！这种非侵入式的给药途径、天然诱导粘膜免疫的优势，以及彻底摆脱冷链储运的便利性，必将成为下一代mRNA疗法（从流感、新冠到呼吸道合胞病毒RSV，乃至肺癌疫苗）争夺的最核心高地。不过，值得注意的是，P24配方的玻璃化转变温度（Tg）在27°C左右，对于在炎热气候下的长期室温储存，未来还需要进一步微调辅料比例以提高Tg，这是接下来配方工程师们可以继续深耕的黄金方向。

Li Q, Shi R, Xu H, AboulFotouh K, Sung MMH, Oguin TH, Hayes M, Moon C, Dao HM, Ni H, Sahakijpijarn S, Cano C, Davenport GJ, Williams RO 3rd, Le Huray J, Cui Z, Weissman D. Thin-film freeze-drying of an influenza virus hemagglutinin mRNA vaccine in unilamellar lipid nanoparticles with blebs. J Control Release. 2024 Nov;375:829-838. doi: 10.1016/j.jconrel.2024.09.030. Epub 2024 Oct 10. PMID: 39293526.