支撑案例 | 南农大解析假单胞菌生防活性物质调控通路！分测中心提供质谱成像关键技术支撑！

近日，南京农业大学高学文教授团队在国际权威期刊《Nucleic Acids Research》发表题为“Regulation of cyclic lipopeptide orfamide A biosynthesis in Pseudomonas protegens by the Gac-Rsm-LuxR Cascade”的研究论文。研究结果全面揭示了生防假单胞菌调控脂肽类化合物orfamide A合成的Gac–Rsm–LuxR 信号通路，为开发基于假单胞菌的微生物生防制剂提供重要理论支撑。南京农业大学已毕业硕士王若伊、已毕业博士俞晨杰、在读博士宋艳为论文共同第一作者。南京农业大学伍辉军教授、顾沁教授，苏州农林职业技术院俞晨杰讲师，江苏省农业科学院乔俊卿副研究员为论文共同通讯作者。高学文教授参与并指导了该研究工作，已毕业硕士生张露露，李平平，朱琳莉和在读硕士付雅丽，在读博士陈荣实、德国洪堡大学Rainer Borriss教授和南京农业大学现代农业分析测试中心实验师丁国华博士为共同作者。

一、研究核心科学问题

Orfamide A是防御假单胞菌Pf-5合成的脂肽类化合物，是该菌株生防活性的核心决定因子。本研究系统探究了GacS/A双组分系统、小 RNA、阻遏蛋白以及两种LuxR型转录因子在orfamide A生物合成过程中的调控互作关系。研究发现，GacS/A通过上调RsmX、RsmY、RsmZ三种小 RNA 的转录，间接调控orfamide A的合成；其中RsmY与RsmZ可协同解除RsmA、RsmE带来的抑制作用，而RsmX功能较弱，仅能拮抗其中一种阻遏蛋白。正向调控orfamide A合成的转录因子LuxR1和LuxR2会被RsmA、RsmE直接抑制 ——两类阻遏蛋白可结合二者mRNA的5''非翻译区，使LuxR调控模块归入 Gac–Rsm信号级联通路。本研究进一步证实，LuxR2 能够激活luxR1基因表达，生成的LuxR1蛋白可结合orfamide A生物合成基因簇的启动子，进而促进该脂肽类化合物合成。尤为重要的是，本研究报告了一个完整的调控级联反应Gac–Rsm–LuxR，能够调控防御假单胞菌Pf-5中orfamide A的生物合成，并展示其在根际中的功能重要性。这种层级级联研究有助于理解环境信号如何通过多层调控层转导，以控制假单胞菌及相关细菌的专用代谢物产生。

本研究中MALDI-MSI 质谱成像实验依托南京农业大学现代农业分析测试中心质谱平台完成，平台质谱成像技术为文章中orfamideA相关调控基因，在植株和MM培养基上调控orfamideA的产量提供了直观、关键可视化证据。

二、质谱成像技术：破解 “原位空间分布” 瓶颈

传统 HPLC、液相定量仅能获得菌体整体代谢物平均含量，无法直观反映培养基、植物根际原位环境下orfamide A 真实分泌与空间分布特征，且检测结果极易受提取溶剂、萃取时长、纯化步骤等提取方法干扰，极易出现目标化合物损失、信号偏低甚至完全检测不到的问题。

南京农业大学现代农业分析测试中心配备布鲁克 UltrafleXtreme MALDI-TOF 质谱成像系统，为本研究完成两大关键可视化验证：

使用 ITO 载玻片培养基双层固体培养，对Pf-5野生株、gacA敲除/回补株、rsmXYZ、luxR1/2、ofaA突变株进行无标记原位扫描。质谱热图直观显示：通路缺陷菌株orfamide A信号强度显著降低，回补菌株恢复野生型分泌水平，印证调控通路功能。

通过幼苗根CMC包埋、冷冻切片、质谱成像流程，对番茄根际orfamide A空间分布进行可视化。证实实验室培养基得到的调控规律可完全复刻于真实植物根系微生态，直接支撑论文核心结论。

该成果充分体现质谱分析平台空间代谢可视化特色技术在微生物-植物互作研究领域具有重要的支撑作用，可为相关研究者提供多方面的分析工作。