基于 timsOmni™ ∑ 质谱平台的糖肽高置信度结构分析

2026-07-17 09:30:20, 4D-组学老虎队布鲁克（北京）科技有限公司-质谱仪器

在2026年ASMS会议上，布鲁克展示了革命性的 timsOmni™ ∑ 实现了无与伦比的多级、超高灵敏度捕获电子转移解离（tExD）碎裂技术，用于糖基化翻译后修饰（PTMs）更深层次的结构和功能表征。精准解析糖链结构对于阐明影响生物功能的糖肽异质性与位点特异性修饰至关重要。timsOmni™ ∑ 平台将离子淌度技术与互补的碰撞/电子双重活化模式相结合，可实现对糖型异构体的高效分离，并为糖链结构的确证解析提供有力支撑。

糖肽表征需同步实现肽骨架断裂与富含结构信息的聚糖碎片生成。timsOmni™ ∑ 平台将淌度分析（TIMS）与高选择性 PASEF 扫描模式及支持可调谐 ECD、hot ECD（hECD）、ECID 和 EID 的 Omnitrap^® 架构相融合。这些基于电子的活化模式可产生互补的肽段与聚糖碎片，从而实现可靠的糖基化位点定位与精细结构解析。本文展示了 Omnitrap^® 内的电子诱导碎裂技术如何突破既往瓶颈，实现对低电荷前体、大分子量聚糖及含多个潜在糖基化位点的 O- 连接糖肽的全面表征。

面向深度表征的互补模式

timsOmni™ ∑ 平台所具备的可调谐电子活化模式（图1）可为糖肽表征提供互补的结构信息。电子捕获解离（ECD）可在完整保留不稳定聚糖基团的同时，产生丰富的肽骨架 c/z 型离子，从而实现 N- 与 O- 连接糖基化位点的可靠定位。该平台高效实现了捕获式电子转移解离（tEXD）：Omnitrap^® 中的离子经高通量电子束辐照后，可在 10–30 ms 的极短反应时间内获得高解离产率。当提高电子能量至电子诱导解离（EID）条件时，会促进高电荷态自由基物种的生成，进而开启替代性解离途径。此外，电子辐照后的碰撞诱导解离（CID）活化可提供互补信息，包括 b/y 型肽骨架离子，以及由糖苷键断裂产生的 Y 离子和跨环断裂产生的 X 离子等大分子量聚糖碎片。

图1. TIMS 与 Omnitrap 的集成实现了多种基于电子的解离策略（ ECD 、 hECD 、 ECID 、 EID 及混合 EXciD 模式），可根据糖肽的电荷状态、质量及结构复杂性进行灵活选择与参数优化。

图2. 利用 ECciD 实验（30 ms 电子辐照时间，20 eV CID 活化）对 SGP 糖肽进行全面表征。在整个 m/z范围内观察到丰富的肽骨架与聚糖碎片，其中包括具有诊断意义的聚糖跨环断裂信号。

前体电荷态与离子淌度

对碰撞能量的调控作用

前体电荷态及离子淌度还显著影响生成高信息量碎片谱图所需的碰撞能量（CE）。PASEF‑EXD 方法可依据前体选择阶段确定的电荷态和 1/K₀ 值动态校准 CE。如图3 所示，ECD 通常比 EID 需要更高的碰撞能量，这反映出电子捕获主要生成较低电荷态产物，而电子电离则倾向于产生较高电荷态离子。

图3. 基于前体离子淌度与电荷态对 tEXD 后 CID 活化进行归一化校准，以实现最优碎裂。

ECID 可诱发额外的糖苷键与跨环断裂，生成的碎片为解析聚糖拓扑结构与连接键型提供了关键线索。EID 进一步提升了大分子 Y 离子及更多跨环碎片的丰度，有助于在色谱时间尺度内区分糖链异构体。对这些碎裂模式的详细分析表明：ECciD 特别适用于 O‑ 连接糖肽的表征；而 EIciD 则在多种聚糖类型中均能产生丰富的特征碎片，可实现复杂型与杂合型聚糖的结构解析（图4）。因此，在糖肽分析中覆盖宽范围的电子能量，使得以往依赖聚糖特异性酶切才能完成的精细结构表征成为可能。

图 4. 乳蛋白酶解物来源糖肽的二级质谱（MS2）数据中，观测到的Y离子聚糖链长中位值

O-连接糖肽的表征与位点定位

ECciD 碎裂模式为 O- 连接糖肽分析提供了互补的结构信息，尤其在处理因存在多个相邻丝氨酸/苏氨酸残基而导致位点定位困难的肽段时优势显著。ECciD 可同时产生携带完整聚糖的 a/z 与 c/z 型肽骨架碎片组合，有效消除聚糖位置的不确定性。此外，该方法生成的 b/y 型碎片既能确证肽段序列，又能在肽段水平上验证聚糖组成，从而实现对 O- 连接糖肽的全面表征。

以足细胞标记蛋白（podocalyxin）肽段 SSHSVTTDLTSTKAEHL 为例，由于存在大量相邻的丝氨酸和苏氨酸残基，该肽段共含有八个潜在的糖基化位点。要对该肽段进行精准表征，需要获得一套携带完整聚糖的连续碎片离子梯，从而在残基水平上精确解析翻译后修饰（PTM）的分布情况。如图 5 所示，PASEF‑EXD 谱图通过保留聚糖的碎片及其互补碎片实现了修饰位点的定位：具体而言，携带完整聚糖的 b₅ 与 c₇ 离子将 H1N1 聚糖的位置限定在 –TT– 区域；而仅在聚糖丢失谱图中观测到的 b₆ 碎片，则间接将糖基化位点锁定在T6上。对于第二个聚糖，保留 H2N2 的 c₁₀ 与 x₅ 离子将其定位范围缩小至 –ST– 模体。将此分析方法应用于其他前体离子时，在 LC‑MS 条件下共鉴定出该肽段骨架上五种不同的聚糖分布模式（图6），充分证明了 ECciD 在解析复杂糖基化图谱方面的卓越效能。

图 5. 基于 ECciD 实验生成的保留完整聚糖的c/z型离子，定位足细胞标记蛋白衍生肽段的O-连接糖基化位点

图6. 利用 ECciD 技术鉴定的足细胞标记蛋白 O-连接糖肽

结论

timsOmni™ ∑ 平台整合淌度分辨前体选择、PASEF 采集与可调谐电子活化碎裂技术，可实现糖肽结构的全面解析。该系统支持宽范围电子能量调控，能在单一工作流程中同时获取肽骨架离子、糖苷键断裂碎片及跨环断裂碎片。依托上述性能，平台可实现 N-、O- 连接糖基化位点的可靠定位，适配宽电荷态区间的前体离子分析，还可提供区分糖型异构体、乃至在高修饰密度肽段中精准定位 N-/O- 连接聚糖所需的关键结构信息。TIMS、PASEF 与 Omnitrap^®技术的联用，为富集样本及复杂生物样本的糖蛋白质组精细表征开辟了一条独特的技术路径。

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参考文献

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