IC50 如何测？拿到数据不会处理？常见活性数值分不清？一文 Get！

2024-12-24 14:28:39, 小 M MedChemExpress (MCE)

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小 M, 小 M, 我导儿开始安排测 IC₅₀ 了，虽然查文献经常遇到……但还是晕😵，概念分不清？不懂如何测？有啥区别？

确实！大家常在文献中看到 IC₅₀、EC₅₀、ED₅₀ 等数值的测定，实验不迷茫~我们先从大家最熟悉的 IC₅₀ 值开始！(PS：福利礼包即将结束！点击免费领~)

IC₅₀ 值及其应用场景

IC₅₀(Half maximal inhibitory concentration) 又叫半数抑制浓度，So，单位是浓度单位，比如 nM、µM 等等。

IC₅₀ 用来指示某一药物或者物质 (抑制剂) 对某些生物过程 (包含此过程中的某些物质，如酶，细胞、受体或是微生物) 达到 50% 抑制效果时的浓度。IC₅₀ 值越低，表示其抑制效力更强。

我们常在文献中看到 IC₅₀、EC₅₀、ED₅₀等等数值的测定，这些指标被广泛应用于药物开发、毒理学、基础研究等领域，为理解药物效应和优化治疗策略提供了有力支持。

IC₅₀ 值的应用：

1. 药物筛选和开发

初步筛选：在药物发现过程中，IC₅₀ 值用于筛选潜在的药物候选分子，以确定其对特定靶标如酶抑制的活性。
优化化合物：通过比较不同化合物的 IC₅₀ 值，研究人员可以优化药物分子的结构，提高其效能。

2. 评估细胞毒性

细胞生物学研究：IC₅₀ 用于评估化合物对癌细胞或其他细胞类型的毒性，帮助研究其对细胞生长和存活的影响。
毒理学研究：在药物安全性评估中，IC₅₀ 值用于确定化合物对正常细胞的影响，评估其潜在的副作用。

3. 药物相互作用研究

联合用药研究：通过测定单独药物和联合用药的 IC₅₀，研究不同药物之间的相互作用和协同效应，以优化治疗方案。

常用实验的 IC₅₀ 值测定

一、激酶抑制剂的 IC₅₀ 值，如何测？

为了寻找新型的 CaMKII 抑制剂作为治疗人类心脏疾病的潜在药物，作者利用高通量系统进行筛选，并在第二次筛选中，对 33 个有潜力的分子化合物进行了 IC₅₀ 值测定，所得 IC₅₀ 最低的前 10 种化合物如下 (图 1)^[1]。

图 1. 抑制 CaMKII-δ 激酶 IC₅₀ 值最低的前 10 个分子及其结构曲线^[1]。

▐ 操作步骤 (供参考^[1])

(1) 激酶自磷酸化：通过将 2 ng/μL CaMKIIδ 重组蛋白与 0.2 mM CaCl₂、10 mM MgCl₂、0.01 mM ATP、200 μM autocamtide-3 (CaMKII-δ 的肽底物)、30 nM CaM 和 0.1 g/mL BSA (来自牛血清的白蛋白) 在含有 25 mM Tris-HCl pH 7.5 的缓冲液中孵育来实现的。

(2) IC₅₀ 值测定：对初筛所得 33 个分子化合物复筛，将其按实验设计加入激酶反应体系中，进行 IC₅₀ 值测定。

(3) 发光测定：通过发光测定监测 CaMKII-δ 磷酸转移酶活性（注意：如果激酶反应不是在室温下进行，在加入 ADP-Glo™ 试剂之前，将板平衡至室温）。

(4) 记录发光：使用微孔板读数仪记录读数。

(5) 数据分析：数据以平均值 ±SEM 表示。使用 GraphPad Prism 版本 8.01 (GraphPad Software, Inc.) 和 SPSS 24.0 软件包 (IBM SPSS Statistics，版本 24.0) 进行统计分析。

发光检测原理：

当 CaMKII-δ 被激活时，它会通过将 ATP 转化为 ADP 来磷酸化底物。在该测定中，CaMKII-δ 的肽底物 (Autocamtide-3) 的磷酸化与 ATP 到 ADP 的转变酶促偶联。ADP-Glo 试剂用于终止激酶反应并去除未反应的 ATP。加入激酶检测试剂终止 ATP 消耗反应并将 ADP 转化为 ATP，然后通过荧光素酶反应将 ATP 进一步转化为光。

图 2. 发光检测酶活性原理图。

二、细胞毒活性试验的 IC₅₀ 值，如何测？

为了揭示吡啶和噻唑衍生物的抗癌活性，以阿霉素为对照药，使用 MTT 法测试噻唑基吡啶类化合物对肺癌 (A549) 细胞系的体外抗癌作用，对其进行了 IC₅₀值测定^[2]。

图 3. 吡啶和噻唑衍生物对肺癌 (A549) 细胞系的抑制作用^[2]。

▐ 操作步骤 (供参考^[2])

(1) 化合物制备：将合成的化合物及参考药物阿霉素溶解于 DMSO 中。准备不同浓度的工作溶液以供实验使用。

(2) 细胞处理：将预培养的细胞系暴露于不同浓度的测试材料，在 37°C 下孵育 24 小时。使用 PBS 清洗去除死细胞。

(3) MTT 染色：向每个孔加入 25 µL 0.5% MTT 染液。在 37°C 条件下孵育 3-4 小时。

(4) 溶解与读数：加入 0.05 mL DMSO 溶解细胞内形成的甲瓒晶体，并在摇床上放置 30 min。利用 ELISA 板读数仪测量各孔的吸光度值。

(5) 数据分析：重复实验三次，计算平均值。细胞存活率计算公式为：(处理组吸光度/对照组吸光度) × 100%。使用 Master –plex-2010 程序确定 IC₅₀ 值。

IC₅₀值的数据计算

IC₅₀ 值的是通过剂量反应曲线 (Dose-Response Curve) 生成，具体方法可能因实验设计和使用的分析软件而有所不同，这需要进行一系列不同浓度的药物处理实验。

▐ IC₅₀ 值的数据处理

实验设计：进行细胞或酶实验，将靶标 (如细胞系、酶等) 暴露于多个不同浓度的药物中。

记录数据：测量药物对靶标的抑制效果，例如细胞存活率、酶活性或代谢产物变化。
处理数据：将所得表格数据进行转化，使用 Graphpad prism 软件计算—创建表格—输入浓度和抑制率—点击 Analyze，选择对数变换--通过非线性回归 (Non-linear regression) 对实验数据进行拟合---得 IC₅₀ 值，其标准曲线为 S 型曲线。

图 4. IC₅₀ 值的标准曲线。

需要注意的是！虽然 IC₅₀ 的应用十分广泛，但 IC₅₀ 值是通过体外实验获得的，仅为体外数据，不能完全反映药物在体内复杂环境下的效果。

ED₅₀、TD₅₀ 和 LD₅₀

活性数值在药理学和生物化学领域非常重要，用于描述药物或分子与靶标之间的相互作用及效果，对于理解药物作用机制、优化化合物结构以及指导临床用药等方面都具有重要意义。

下图是小 M 为大家整理的关于 ED₅₀、TD₅₀ 和 LD₅₀ 的简要汇总~

小结

本期主要为大家介绍了 IC₅₀，并为大家整理了关于 ED₅₀、TD₅₀和 LD₅₀ 的简要汇总！下期为大家介绍它的好 “兄弟” EC₅₀~，当然还有其他活性数值，内容精彩，值得等待！未完待续……

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[1] Zhang J, et al. Novel CaMKII-δ Inhibitor Hesperadin Exerts Dual Functions to Ameliorate Cardiac Ischemia/Reperfusion Injury and Inhibit Tumor Growth. Circulation. 2022 Apr 12;145(15):1154-1168.

[2] Ashmawy FO, et al. Synthesis, In Vitro Evaluation and Molecular Docking Studies of Novel Thiophenyl Thiazolyl-Pyridine Hybrids as Potential Anticancer Agents. Molecules. 2023 May 23;28(11):4270.

[3] Gui, H., et al. Effects of Boletus Poisoning on Estrogen Receptors and Neurotransmitters in Rats Based on ERk1/2 Pathway. Neural Process Lett 55, 193–203 (2023).

[4] Abal P, et al. Acute Oral Toxicity of Tetrodotoxin in Mice: Determination of Lethal Dose 50 (LD50) and No Observed Adverse Effect Level (NOAEL). Toxins (Basel). 2017 Feb 24;9(3):75.