Gator® BLI 技术在表观遗传学研究中的应用

2024-08-09 15:29:38, Gator Bio Gator Bio 小鳄生物

表观遗传学

表观遗传学概念是由英国科学家 Waddington 于 1942 年首次提出，他将其定义为没有基因型变化的表型变化，用来解释生长发育的相关机制。随着时间推移和研究深入，如今人们普遍认为表观遗传学是一种不改变 DNA 序列而产生可遗传表型变化的调控机制，并广泛存在于生长发育和疾病机理研究中。

图 1：表观遗传学主要机制（来源：遗传）

表观遗传学的主要研究内容包括：DNA/RNA 甲基化、组蛋白修饰、核小体定位、非编码 RNA 和染色质三维结构等，这些表观修饰构成了生物个体特异性的表观基因组，也为细胞多样性提供了一种调节机制。

Gator^® BLI 技术可通过直观的相互作用研究分子机制，提供直接且关键的数据，让我们用几篇高分文章来看看 Gator^® 在表观遗传方向的具体应用：

Nature 新作，Gator^®助力发现

H3K9me3 特异性 “ 阅读器 ” TNRC18^[1]

2023 年 11 月，杜克大学王刚 ( G Greg Wang ) 教授和加州大学河滨分校宋吉奎 ( Jikui Song ) 教授领导的团队在 Nature 杂志上在线发表了题为 TNRC18 engages H3K9me3 to mediate silencing of endogenous retrotransposons 的研究论文。该论文首次报道了一类 ERV 元件特异的 H3K9me3 识别蛋白 TNRC18。TNRC18 是一种 H3K9me3 特异性 “ 阅读器 ”，通过结合 H3K9me3 介导内源逆转录转座子的沉默，并对宿主基因组完整性、转录调控、免疫和发育产生重大影响。

在此之前，TNRC18 是一种了解较少的染色质调节因子，它识别 H3K9me3 来调控 ERV1 元件（例如 LTR12 ）的沉默。H3K9me3 对于基因抑制和异染色质形成的调节、细胞命运决定和生物体的发育至关重要。生化、生物物理和结构研究确定了 TNRC18 的 C 端 BAH 结构域——TNRC18 ( BAH ) 是一种 H3K9me3 特异性 “ 阅读器 ”。此外，TNRC18 的 N 端是直接招募协同抑制因子（例如 HDAC-Sin3-NCoR 复合物）的平台，从而加强对 H3K9me3 标记的 ERV 的最佳抑制。

点突变破坏了 TNRC18 ( BAH ) 介导的 H3K9me3 结合，导致新生小鼠死亡，并在多种哺乳动物细胞模型中导致内源逆转录病毒（ ERV ）表达下调，这影响了顺式调控元件的布局，从而影响了基因表达程序。

BLI 实验思路

使用 Gator^® 仪器进行 BLI 测试获得的体外实验结果表明：TNRC18-BAH 与含有组蛋白 H3K9（ H3Kc9me3 ）的核小体亲和力可以达到约 18.8nM。

实验流程：SA 光纤生物传感器先固化 biotin 标记的 H3Kc9me3-modified NCP，再结合不同浓度的 TNRC18-BAH，10 分钟内即可完成互作检测。

图 2：Gator^® 检测 TNRC18-BAH 与核小体的相互作用

G-四链体依赖的小分子代谢物调控基因转录

和表观遗传修饰的新机制^[2]

G-四链体（ G4 ）是富含鸟嘌呤的单链核酸折叠形成的一种非经典核酸二级结构，它们在进化上保守，广泛分布于端粒、基因启动子、转录因子结合位点等区域，被认为参与了基因转录、DNA 复制等多种基本生命过程，并与神经退行性疾病、肿瘤等人类重大疾病密切相关。

G-四链体已被视作 DNA 靶向治疗的重要靶点，其小分子配体也已开发并应用于抗肿瘤治疗。然而，G-四链体受其配体调控的具体机制，以及 G-四链体和其配体实现生物学功能的具体机制仍不完全清楚。

武汉大学泰康医学院（基础医学院）梁凯威/房萍萍课题组报道了一个 G-四链体依赖的小分子代谢物调控基因转录和表观遗传修饰的新机制。该研究建立了天然卟啉类代谢物在染色质上分布的全基因组检测方法，并阐明血红素通过促进全基因组范围内 G-四链体的形成，影响基因转录起始，改变组蛋白修饰图谱的全新调控机制（如图 3 ）。

图 3. 假设模型：血红素参与基因转录调控的两种途径

研究人员首先利用基于生物膜干涉技术的 Gator^® 确定了卟啉类代谢物血红素（ Hemin，651.94 Da ）及原卟啉（ PpIX，562.66 Da ）与 G-四链体的直接结合（如图 4 ）。并通过靶向代谢组学技术检测了血红素及原卟啉在不同细胞内的分布及含量，发现血红素分布在染色质组分。利用其它方法发现血红素结合位点与 20-30% 的 G-四链体重叠，并且血红素能够快速促进细胞内这些重叠的 G-四链体的形成，抑制血红素结合的基因启动子区域的转录起始，减少组蛋白 H3K4me3 以及 H3K27ac 修饰，表明了卟啉类代谢物在基因转录调控以及组蛋白修饰调控中的作用。进一步的研究发现，G-四链体的状态与已报道的经典的血红素-BACH1-NRF2 调控的增强子激活无关，说明血红素-G-四链体的转录调控途径有别于经典的转录因子介导的转录调控途径，这将加深研发人员对 G-四链体生物学的了解以及细胞代谢产物对基因调节的贡献。

图 4. Gator^® 分别检测 MYC-G4 与 PpIX，hemin 的结合动力学

BLI 实验思路

文章利用 Gator^® 检测分子互作，实验流程非常简单：一根 SMAP 光纤生物传感器固化生物素化的 G-四链体核酸，分别结合从低浓度至高浓度的 PpIX/Hemin，再用一根传感器作为 blank 对照，2 根传感器进行非特异实验，完成双扣除，大大降低使用成本。

乙酰化稳态调控核糖体组装和功能^[3]

乙酰化是一种全局性的翻译后修饰 ( PTM )，在调节原核生物和真核生物的细胞过程中起着至关重要的作用。核糖体是将 mRNA 翻译成蛋白质的重要细胞机器，也是抗生素的常见靶标，许多临床上重要的抗生素，如氨基糖苷类、氯霉素类、四环素类和大环内酯类，可靶向延长周期。细菌乙酰化组学研究揭示了核糖体蛋白的广泛乙酰化。然而，目前蛋白质合成的效率和保真度的调控尚不完全清楚，乙酰化在调节核糖体功能中的作用也仍然知之甚少。

2023 年 9 月 23 日，上海交通大学姚玉峰、Lu Jie及东北大学范永强在《Nucleic Acids Research》上在线发表题为 “ Global profiling of ribosomal protein acetylation reveals essentiality of acetylation homeostasis in maintaining ribosome assembly and function ” 的研究论文。该研究系统地分析了鼠伤寒沙门菌核糖体蛋白 ( r-蛋白 ) 的乙酰化修饰，并在 52个 r-蛋白中共鉴定出 289 个乙酰化赖氨酸残基。研究发现，乙酰化通过调节 r-蛋白与 rRNA 的结合，在成熟的 70S 核糖体复合物的组装中起着至关重要的作用。此外，适当的乙酰化对于延伸因子与多聚核糖体的相互作用，以及调节核糖体翻译效率和保真度也很重要。乙酰化的失调可以改变细菌对核糖体靶向抗生素的敏感性。

图 5：文章模式图

文中通过质谱发现核糖体蛋白 L7/L12 中的 K65 和 K70 可以被 Pat 和 AcP 乙酰化，另外通过蛋白质印迹发现，L7/L12 中 K65 或 K70 的突变（ K 至 Q 或 K 至 R 突变）会降低与翻译延伸因子的结合。进一步通过 Gator^® BLI 测定了核糖体蛋白（ r-蛋白）WT L7/L12 及其突变体与翻译延伸因子（ EF-Tu ）的结合亲和力。结果发现，WT L7/L12 和 EF-Tu 之间的平衡解离常数（ K_D ）值为 0.74±0.11μM，而突变体 65Q、65R、70Q 和 70R 与 EF-Tu 的 K_D 分别为 1.52±0.40、2.69±0.46、1.31±0.42 和 1.81±0.31μM（图 6 ）。即 r-蛋白突变体与 EF-Tu 的结合明显弱于 WT L7/L12。这些结果表明，r-蛋白的乙酰化状态对于调节其与翻译延伸因子的结合至关重要，L7/L12 K65 和 K70 的乙酰化与核糖体与 EF-Tu 的结合、翻译效率和保真度有关。

BLI 实验思路

Gator^® 采用 BLI 技术可以非常方便、快速的检测核糖体蛋白和翻译延伸因子的亲和力，具体流程是使用 SA 光纤生物传感器固化生物素标记的 EF-Tu，再结合不同浓度的 r-蛋白 WT L7/L12，以及突变体，仅需花费不到 2 个小时就可以完成 5 对分子互作亲和力对比。

图 6：Gator^® 检测 r 蛋白 WT 及其突变体与 EF-Tu 的结合亲和力

目前，很多制药公司正在积极参与 “ 表观遗传学药物 ” 的开发，主要是分析各种化合物对表观遗传学机制的影响。表观遗传学研究考虑了个体基因组、所处环境及生活方式等诸多因素的影响，将有助于人们利用表观遗传修饰手段预防、诊治各种疾病，加速精准医疗新时代的到来。

快用 Gator^® BLI 来辅助您的研发之路吧。

参考文献：

[1]. Shuai Zhao, Jiuwei Lu et al. TNRC18 engages H3K9me3 to mediate silencing of endogenous retrotransposons. Nature（2023）

[2]. Conghui Li, Zhinang Yin et al. G-quadruplexes sense natural porphyrin metabolites for regulation of gene transcription and chromatin landscapes. Genome Biology (2022) 23:259.

[3]. Yongqiang Fan, Jie Lu, Yu-Feng Yao, et al. Global profiling of ribosomal protein acetylation reveals essentiality of acetylation homeostasis in maintaining ribosome assembly and function. Nucleic Acids Research. 2023.