【文末福利】抽丝剥茧探案五：RSD不佳原来是因为他！

Hello小伙伴们大家好，液相色谱是我们最常用的大型分析仪器之一，是我们工作的好搭档，由于使用或维护不当，我们的搭档偶尔也会出现一些小问题。

这不，我们的售后工程师又接到客户求助了，今天小编就跟大家分享故障排查实例一则，划重点：思路和逻辑很重要，记得做笔记噢。

某天，“叮铃铃叮铃铃”月旭杨探长的电话响起，客户实验室的月旭HPLC高效液相色谱仪搭配示差检测器做糖类物质，出现保留时间稳定，但峰面积重复性不佳的情况，客户方法要求RSD<0.3%，实际RSD达到0.8%，遂向杨探长报案求助。

维修前RSD：0.8%

杨探长到达案发现场后，经过交流，了解到更具体的情况，接下来杨探长就开始进行查案了。

首先，我们要知道引起峰面积重复性差的原因都有哪些？一般情况下，多半是自动进样器的问题，当然我们也不能轻易排除其他模块的可能性，需要一一排查。

跟着杨探长一起抽丝剥茧，查案吧。

运行仪器，打开液相泵，观察各个模块的管路连接处是否有漏液，运行一段时间后，检查仪器各模块管路连接处有无液体渗出，排除了因系统漏液而造成的峰面积RSD影响。

本案中使用的是纯水作为流动相且保留时间稳定，可以排除系统有漏液的情况而且泵流速稳定，此步骤为附带例行排查。观察自动进样器注射器有无气泡，经确认注射器内并无气泡，那么峰面积RSD大，并不是因注射器进样体积变化造成的，真凶到底是谁呢？

打开自动进样器洗针操作，观察进样注射器内是否有空气进入与进样口打样时是否有液体渗出，观察到进样口有液体渗出，那么问题可能就是出在这里了。

1. 启动调试软件，观察进样针在进样口的深度是否合适，经杨探长观察进样深度无问题。

2. 拧松进样口螺钉并取出，更换新的进样口隔垫。

重新运行仪器，进行样品重复性测试，计算结果算出RSD：0.7824%。

仍无法达到客户要求的RSD，难道还有帮凶？重新仔细检查仪器，观察发现在进样口密封处有进样小瓶隔垫的碎屑，经拆卸清理后，按照色谱柱说明书的建议，将色谱柱及保护柱平衡12h，重新进行重复性测试。

维修后RSD：0.2%

我们再延伸说一下峰面积RSD大的问题，此处应划重点，快准备好小本本。

1）自动进样器

当峰面积RSD偏大时，首先想到进样器，我们遇到的问题在某种程度上取决于进样器的类型，通常情况下，在测量进样体积时形成的气泡是问题的主要来源。

如果我们使用的是手动进样器，请确保注射器中没有气泡。使用固定回路进样器时，确保没有空气进入进样器流路。

还有一种情况值得注意，如果样品瓶隔垫密封在进样针周围，当大体积吸样品时会产生负压，会使气泡进入后续流路，任何气泡的形成都会导致每次进样之间进样量的差异，此时我们可使用预开口的进样瓶隔垫。

我们总结了与自动进样器有关的导致RSD异常的情况如下：

鬼峰捕集柱

1）如果待测物浓度差异很大，并且单个样品的峰面积在两次或三次进样后才保持恒定，样品残留可能是出现以上问题的原因。每次进样后彻底清洗进样器，确保用于针头清洗的溶剂与样品有良好的互溶性。

2）峰面积的减少也可能是由于温度变化引起的，但是这种影响相对较小，如果将样品从冰箱中取出并放入自动进样盘中，样品将缓慢升温至进样器温度，并且溶剂会膨胀。

因此，当样品达到样品盘的温度时，我们最初进的样品体积比随后的大，排除此类情况可通过将样品放置在样品盘后充分放置使样品稳定与进样器温度保持一致后再进样。

3）样品本身的问题，例如在反相色谱中某些蛋白质在初始梯度过程中不会完全洗脱，在后续的空白梯度中洗脱下来，如果发生这种情况，则需要在两次分析之间运行空白梯度。

样品还可能“不可逆地”吸附在某些色谱柱上。全新色谱柱获得的峰面积可能随着重复进样而缓慢增加。这是因为样品会与色谱柱管的活性位点结合。这些位点一旦饱和，获得了可重现的峰面积，可以使用其他样品来饱和活性位点，或使用金刚石柱来减少特异性吸附。

金刚石柱（点击图片了解详情）

● 流速的随机变化也会导致峰面积波动，通常是由单向阀故障或泵头中的空气引起的，一般伴随着保留时间的波动，可以通过监控背压来排查。

● 流速变化的另一个潜在原因是系统高压侧泄漏，目前主流的液相泵均带有漏液传感器，比较容易排查这种情况。

积分问题是比较难解决的，通过简单的目测即可发现软件积分峰的方式的重大变化，但很难发现更细微的变化。信噪比为100或更低时，拖尾峰经常会产生明显的积分误差。基线噪声限制了积分的精度，但是随着峰前延或峰拖尾的出现，问题变得更加严重。

可以尝试设置不同的积分参数重新处理数据，然后查看是否可以解决问题。

又一悬案告破，回到办公室的杨探长终于松了一口气，准备泡上一杯茶整理一下案卷。刚刚打开茶叶盒，“叮铃铃叮铃铃...”杨探长的手机又响起了，接起电话的杨探长眉头紧锁，挂掉电话后，杨探长就又奔赴现场了。案卷堆积如山的桌子上，孤零零的留着一盒只打开盖子的茶叶.....

这次杨探长又遇上了什么实验谜案？又能否抽丝剥茧巧妙化解？关注月旭科技公众号，锁定【抽丝剥茧探案】系列，我们下期再见！

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