安捷伦 Imaging Reader 助力默沙东开发全新 mRNA 疫苗体外效价预测方法

背景介绍

mRNA 药物是一种新型的生物技术药物，其历史可以追溯到 20 世纪 60 年代。最初科学家们是期望通过 mRNA 分子来传递基因信息，用以治疗恶性肿瘤等疾病。伴随 2019 年 COVID-19 大流行，mRNA 技术得到突飞猛进的发展，目前已经上市的 mRNA 药物主要是针对 COVID-19 的感染性疾病疫苗，但是在肿瘤治疗领域、致敏性疾病、蛋白替代疗法等应用领域，也有相当多的 mRNA 产品进入临床研究阶段。

目前，基于 LNP（核酸脂质纳米颗粒）递送载体的技术是 mRNA 药物的重要平台，该平台在其他病原体上的进一步开发和应用是极具潜力的，因此需要更加便捷高效的能够预测疫苗有效性的分析方法和工具，从而评价候选 mRNA 疫苗的性能，并将它们与预期的免疫反应联系起来。

呼吸道合胞病毒 (Respiratory Syncytial Virus, RSV) 是一种常见的病毒，主要感染呼吸道上皮细胞，引起婴幼儿呼吸道感染，目前，预防 RSV 感染的最有效方法是接种疫苗。然而，由于 RSV 的变异性较强，疫苗的研发和应用还面临一定的挑战，因此靶向 RSV-F 蛋白的 mRNA 疫苗极具市场前景。2023 年，默沙东分析方法开发部门 (Analytical Research & Development) 在 Vaccines 上发表了关于 mRNA-LNP 技术体外效价预测评估的方法学文章，主要介绍了应用高通量成像分析法开展 RSV（呼吸道合胞病毒）mRNA-LNP 疫苗效力的方法。

研究方案介绍

由于 RSV-F 表达效率在细胞系之间差异显著，研究者首先评价了包括 HepG2 在内的常用的 6 种细胞系的适用性。不同细胞细接种 96 孔板后，贴壁生长到 90% 汇合度，加入研究用 mRNA-LNP 疫苗转染孵育 16h 后，固定细胞，免疫荧光染色法处理样本，随后放入 Agilent BioTek Cytation3 设备中对所有样本进行同样标准的荧光图像采集，并通过 Gen5 软件分析细胞内 RSV-F 蛋白的表达量。

统计结果表明：其中 A549 细胞未显示可检测到的蛋白表达，而 Vero、HeLa、HEp-2 和 CaCo-2 中的 RSV-F 表达表现出明显的钩状效应，在最高剂量下仍只能观察到非常低的 RSV-F 表达，表明这些细胞系 ApoE 产生的有限而致使内吞能力较低。加入 ApoE 后能够逆转此现象（图 A-G）。

HepG2 细胞提供了完整的 S 形剂量-反应曲线，上渐近线收敛在完全细胞转染（> 90%）上，可实现广泛的动态和剂量反应范围，补充 ApoE 会导致更陡的斜率，并且提高测定灵敏度，（EC50 下降 20%，图 1G）。

图 1：6 种细胞株适用性筛选

由于该方案的检测方法是高通量成像，需要细胞样本以单层培养为佳,但当 HepG2 汇合度增加时，细胞明显发生聚集和堆叠（图 2A）。

研究团队通过加入模拟体内条件的Ⅰ型胶原包被板上进行接种，随着接种密度的降低明显看到细胞单层覆盖，细胞密度为 3.0×104 时提供了最稳健的结果（图 2D），在该密度下，转染 16h 时，转染效率> 95%，EC50值 14.0，表明检测灵敏度和动态范围均大幅提高，最终确定转染 16h 作为最佳效价测定时间（图 2G）。

图 2：细胞单层培养条件优化

抗原 mRNA 易受多种降解反应的影响，包括水解和氧化，以及通过脂质加合物形成的化学修饰，而评价不同降解程度的 mRNA 在效力上的损失方法很困难，研究团队通过制备了一组不同 N/P 比的样品(其中，N 指代脂质的胺基团，P 指代mRNA上的磷酸盐，D)，来模拟疫苗的降解，用于评价该方法学对不同 mRNA 剂量的灵敏度。

研究发现，而当 mRNA 量大于 10ng 时，由于内吞作用饱和、mRNA 量受限，细胞表达 RSV-F 的能力开始与 N/P 值呈反比，说明该方法对于 mRNA 表达是灵敏度良好 (图 3AB) 并且可以用于监测 mRNA 的实时降解情况（图 C）。

图 3：对模拟降解样本的不同 mRNA 含量的 LNP 样本的效价检测灵敏度验证

此外，PEG 是 LNP 重要组成部分，PEG 层的比例不同，会影响 LNP 的摄取。研究团队进而评估了该方法学对不同 PEG 浓度和不同 LNP 粒径的样本的检测灵敏度。

统计结果显示，较大与较小粒径都会降低 mRNA-LNP 蛋白表达，因此应首选中间粒径（100nm±30nm，图 4B）以保证内吞作用更快发生，而不同 PEG 占比也具有敏感性，将 PEG 含量提高到 1.5% 以上时，效力下降（图 4C）。

图 4：对不同 LNP 尺寸和 PEG 占比样本效价检测灵敏度的验证

研究结论

Cytation7 多模式微孔板成像系统：mRNA-LNP 转染效率和蛋白表达高通量成像

Gen5 Image 软件：自动化图像拼接、细胞计数、抗原蛋白表达定量分析，EC50 曲线拟合

406FX：微孔板细胞铺板、免疫荧光染色操作洗板步骤和分液步骤