2023-11-25 13:56:13, 上海应用部 月旭科技(上海)股份有限公司
在液相色谱方法开发过程中,色谱柱对于分离效果的影响是最大的。色谱柱的参数包括:键合相、柱长、直径、粒径、孔径。
做过液相的工程师肯定都深深记牢这句口诀:
● 同等长度的色谱柱,粒径越小,分离效果越好;
● 同等粒径的色谱柱,长度越长,分离效果越好;
● 同等粒径的色谱柱,内径越小,最佳的体积流速越小。
那么,在相同的方法条件下,同等长度的色谱柱,粒径越小,分离效果一定越好吗?小编带您在实操中一探究竟。
(图片来源:baotu)
案例一:儿茶酚胺及代谢物的测试
儿茶酚胺即含有邻苯二酚(即儿茶酚)结构的胺类化合物,包括多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素及它们的衍生物。
图1 Xtimate® C18(2.1*100mm,1.8μm)
测试儿茶酚胺及代谢物
图2 Xtimate® C18(2.1*100mm,3μm)
测试儿茶酚胺及代谢物
在LC-MS(液相色谱串联质谱)检测时,肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、甲氧基肾上腺素(MN)和甲氧基去甲肾上腺素(NMN)这5个物质极性较大。
在月旭Xtimate® C18(2.1*100 mm,1.8μm)规格的色谱柱上保留均较弱(图1)。尽管DA和MN在质谱上可以分离,但DA和MN色谱上未能分离,在临床测试中,我们还是希望代谢物在色谱上也能分离。
在相同的条件下,仅更换使用Xtimate® C18(2.1*100mm,3μm)规格的色谱柱,5个物质保留均增加,在色谱上达到完全分离(图2)。
案例二:某杂质A和杂质B的分离
图3 AQ-C18(4.6*250mm,3μm)
测试杂质A和杂质B
图4 AQ-C18(4.6*250mm,5μm)
测试杂质A和杂质B
从上两图中可以看出,在方法不做大的调整情况下,使用月旭AQ-C18(4.6*250mm,3μm)规格的色谱柱,杂质A和杂质B之间的分离度仅达到1.2(图3)。经过多种方法的优化,杂质A和杂质B的分离度仍徘徊在1.2左右。
更换月旭AQ-C18(4.6*250mm,5μm)规格的色谱柱,仅调整流速,杂质A和杂质B之间的分离度达到1.6(图4),满足分析要求。
原理分析:
Van Deemter方程第一项即为涡流扩散项。色谱柱中充满了固定相填料,而这些填料的存在会阻碍溶质分子运行,填料粒径越大,溶质分子“绕行”距离就越远,即在填料孔径中停留的时间就越长。
在案例一中:儿茶酚胺类物质属于强极性物质,在色谱柱上保留弱。在相同填料、相同内径和长度的色谱柱以及检测条件下,相同流速的流动相对保留在3μm粒径的UHPLC色谱柱上的儿茶酚胺类物质的洗脱能力比1.8μm粒径的UHPLC色谱柱的要弱,所以达到了分离度增加的效果。
在案例二中:色谱柱均为4.6*250mm规格的色谱柱,仅粒径不同。该规格下5μm粒径的色谱柱最佳流速为1mL/min,3μm粒径的色谱柱最佳流速需要达到1.67mL/min,而这个流速下的压力已经超过HPLC的耐压值,故无法采用最佳流速。最终,5μm粒径的色谱柱使用的是最佳流速1mL/min,3μm粒径的色谱柱仅使用0.8mL/min的流速,远低于最佳流速,故分离效果并没有5μm色谱柱好。
经过以上两个案例,对于较难分离的分析物,小伙伴们如果尝试多种方法仍未达到令人满意的分离效果,不妨尝试把色谱填料的粒径改大或改小,都可以试试,可能会有意想不到的效果哦!
作者:韩燕
排版:赵林
审核:邹天骏
如果您想了解更多内容,欢迎联系月旭科技销售人员或拨打400-810-6969服务热线,我们将竭诚为您服务。
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