五步交叉参照法评估毒性数据缺失的化合物的毒性

在药品的质量研究中，我们可能会遇到毒性数据缺失的化合物，而项目的时间或者预算不允许我们专门为这些化合物开展毒理学实验。不过值得庆幸的是，现在的数据库数据越来越完善，让我们可以有更多的机会在现有数据的基础上建立一套系统、科学的评估方法，以最低的成本和最高的效率评估目标化合物的毒性。本文基于我们近年的实践工作，总结出了一套可操作性强的“五步交叉参照法”，以供各位同行老师参考。

本法参考ECHA Version 2.0 – July 2016 《如何使用动物试验的替代品来满足REACH注册的信息要求（How to use alternatives to animal testing to fulfil your information requirements for REACH registration）》（参考资料1）中的“交叉参照（Read Across）”方法和《使用结构、反应性、代谢和物理化学相似性来评估类似物对基于SAR的毒理学评估的适用性的框架（A framework for using structural, reactivity, metabolic and physicochemical similarity to evaluate the suitability of analogs for SAR-based toxicological assessments）》（参考资料2）中的模拟识别和评估流程进行。

本方法提出了一种基于专家指导意见的系统的评估过程，用于评估SAR（结构-活性关系）毒理学评估中的类似物。其中包括根据潜在类似物与缺少毒理学数据的化合物（目标化合物）的结构、反应性、代谢和物理化学相似程度对其进行分类，然后以系统的应用化学、生物化学和毒理学原理对其建立全面的评价体系，同时识别和评估可能给SAR评估带来不确定性的因素，并最大限度地合理利用现有可用的数据。

如果目标化合物有几个具有合适数据的类似物，我们就可以使用最坏情况方法进行预测。在这种情况下，对每一对源物质和目标物质进行交叉参照评估，以证明最坏情况是合理的。当在几种物质之间采用交叉参照时，使用“分类法”将这几种物质根据物质之间确定的结构相似性和允许的差异分组在一起。由于结构的相似性，结果要么相似，要么遵循某种规律。当然，前提是目标物质组内预测的基础必须是严谨科学的(如“最坏情况”或趋势分析)。

本方法具体评估流程如图：

本次对以下两个化合物进行交叉参照评估，这两种化合物均含烷基氯，不属于ICH M7的注5中单官能团烷基氯结构，若无其毒性数据，需要按TTC（1.5ug/day）进行控制。两个化合物分别结构如下：

化合物1：

化合物2：

Step 1：检索相似结构化合物

表1为通过软件筛选出的化合物1和化合物2相似的结构:

表1. 化合物1和化合物2的相似结构筛选

Step 2：确定是否含相同结构片段

通过结构分析，化合物1含烷基氯的酯，在C链上接着羟基；化合物2含烷基氯的醇，在C链上也接着羟基，因此剔除了上表中的酸、醛和醚类化合物，并按酯和醇进行分类，与化合物1和化合物2分别进行对比，得如下对比表，分别为表2和表3：

表2. 化合物1的相似结构化合物

表3. 化合物2的相似结构化合物

Step 3：确定化合物相似性

由于化合物1和2均含烷基氯，本法通过确定是否含相同的警示片段和pKa、Log P等信息来确定化合物的相似性，得表4和表5：

表4. 化合物1与相似结构化合物的警示片段和理化性质

该组化合物均含烷基氯的酯，Log P显示化合物1的亲水性最强，相比其他化合物更易代谢。

表5. 化合物2与相似结构化合物的警示片段和理化性质

该组化合物均含烷基氯的醇，Log P显示化合物2的亲水性最强，相比其他化合物更易代谢。

Step 4：检索相似化合物的毒性信息，如基因毒性、致癌性、LD50、TD50，长期毒性等，并汇总如下表6和表7：

表6. 化合物1毒性数据交叉参照（说明：“+”表示阳性数据，“-”表示阴性数据。）

表7. 化合物2毒性数据交叉参照（说明：“+”表示阳性数据，“-”表示阴性数据。）

Step 5：通过对比得出相对保守的毒性数据

化合物1综合评估：

化合物1使用了类似物进行了物理性质、代谢能力（以Log P作为依据，Log P越小，越亲水，容易代谢，该值越大，越亲酯，代谢能力变差）、警示片段、基因毒性、致癌性、短期毒性及慢性毒性数据对比，该类似物中均为含烷基氯的酯，通过对比归纳如下：

• 化合物1在该组类似物中，亲水性最强，更易代谢；

• 表6中2、3、4号化合物均显示无基因毒性，3和4号化合物无致癌性，5号化合物无基因毒性与致癌性信息，因此化合物1基因毒性与致癌性的可能性较低；

• 从短期毒性数据LD50值来看，亲水性越大，毒性越低，化合物1的毒性显示最低，符合该规律；

• 根据以上信息，化合物1在该组类似物中基因毒性与致癌性的可能性较低，亲水性最大即代谢能力更好，其结构、物理性质、化学性质与4-氯乙酰乙酯乙酯最为接近，可参照4-氯乙酰乙酯乙酯的毒性数据或者该组类似物毒性最低值的PDE值；

• 本次若选择具有慢性毒性数据的4-氯乙酰乙酯乙酯，也是三个化合物数据中最低值的PDE，则为114ug/day；

• 若使用ICH M7注释中注5的单官能团烷基氯化物的TD50值36mg/kg/day计算，相当于36ug/day；

• 因此，保守起见，可按ICH M7注释中注5的单官能团烷基氯化物的TD50值36mg/kg/day作为限度计算依据，该数据远大于TTC 1.5ug/day。

  
  

化合物2综合评估：

化合物2使用了类似物进行了物理性质、代谢能力（以Log P作为依据，Log P越小，越亲水，容易代谢；该值越大，越亲酯，代谢能力变差）、警示片段、基因毒性、致癌性、短期毒性及慢性毒性数据对比，该类似物中均为含烷基氯的醇，通过对比归纳如下：

• 化合物2在该组类似物中，亲水性最强，更易代谢；

• 表7中，3-6号化合物均显示基因毒性，3和5号化合物具致癌性，因此化合物2基因毒性可能性较高；

• 根据以上信息，化合物2在该组类似物中基因毒性的可能性较高，亲水性最大即代谢能力更好，其结构、物理性质、化学性质与3-氯-1,2-丙二醇最为接近，可参照3-氯-1,2-丙二醇的毒性数据或者该组类似物毒性最低值的PDE值或最低值的TD50值；

• 若以3-氯1,2-丙二醇作为参照，其慢性毒性的PDE为1.474mg/day；

• 若使用2-氯乙醇的TD50 87.1mg/kg/day，相当于0.087mg/day；

• 若使用ICH M7注释中注5的单官能团烷基氯化物的TD50值36mg/kg/day计算，则相当于0.036mg/day；

• 因此，保守起见，可按ICH M7注释中注5的单官能团烷基氯化物的TD50值36mg/kg/day作为限度计算依据，该数据远大于TTC 1.5ug/day。

参考资料

1. ECHA 《How to use alternatives to animal testing to fulfil your information requirements for REACH registration》

2.Blackburn, K., Bjerke, D., Daston, G., Felter, S., Mahony, C., Naciff, J., … Wu, S. (2011). Case studies to test: A framework for using structural, reactivity, metabolic and physicochemical similarity to evaluate the suitability of analogs for SAR-based toxicological assessments. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 60(1), 120–135. doi:10.1016/j.yrtph.2011.03.002